癌理通膏外敷治療癌性疼痛的機制研究

陳學彰 田華琴 梁貴文 王斌 李宏良 葉偉瓊

〔摘要〕 目的 觀察癌理通膏對BALB/c癌性疼痛裸鼠的鎮(zhèn)痛作用及對腫瘤生長、脊髓神經(jīng)生長因子（NGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）表達的影響。方法 通過在BALB/c裸鼠大腿外側近臀部處皮下注射Walker 256乳腺癌細胞的方法建立裸鼠癌痛模型，動態(tài)觀察癌理通組和模型組裸鼠的自發(fā)痛評分、腫瘤體積的變化，剝離腫瘤比較兩組腫瘤重量的差異，RT-PCR法檢測兩組脊髓NGF、TNF-α、ET-1、β-EP的含量變化。結果 癌理通組裸鼠從第7天起自發(fā)痛評分明顯低于模型組，持續(xù)到第10天（P<0.05），腫瘤體積從第3天起明顯小于模型組，持續(xù)到第10天（P<0.01）。與模型組比較，癌理通組腫瘤重量（P<0.01）、脊髓NGF（P<0.01）及TNF-α（P<0.05）的含量均明顯下降，脊髓β-EP含量明顯升高（P<0.05），脊髓ET-1含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 癌理通膏能明顯改善BALB/c裸鼠的癌性疼痛，其作用機制可能與癌理通膏抑制腫瘤的生長、降低脊髓NGF、TNF-α含量、升高脊髓β-EP的含量有關。

〔關鍵詞〕 癌理通膏;癌性疼痛;腫瘤壞死因子-α;神經(jīng)生長因子;β-內(nèi)啡肽;內(nèi)皮素-1

〔中圖分類號〕R285.6 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.012

〔Abstract〕 Objective To observe the analgesic effects of external application with Ailitong Ointment on BALB/c nude mouse with cancer pain and its impact on tumor growth， spinal nerve growth factor （NGF）， tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， endothelin-1 （ET-1） and beta-endorphin （β-EP） expressions. Methods Walker 256 breast cancer cells were hypodermically injected in lateral thigh of BALB/c nude rats to establish nude rat model of cancer pain. The changes of spontaneous pain scores， gross tumor volume in the Ailitong group and the model group were dynamically observed. Tumor tissues were stripped to compare the tumor weight in the 2 groups; RT-PCR was used to detect the changes of spinal NGF， TNF-α， ET-1 and β-EP levels. Results From day 7 to day 10， spontaneous pain scores in the Ailitong group were significantly lower than the model group （P<0.05）; From day 3 to day 10， tumor volume in the Ailitong group was significantly smaller than model group （P<0.01）. Compared with the model group， the tumor weight （P<0.01）， NGF levels （P<0.01） and TNF-α levels （P<0.05） in the Ailitong group were significantly decreased; β-EP levels were significantly increased （P<0.05）; ET-1 levels between the 2 groups were not significantly different （P>0.05）. Conclusion Ailitong Ointment can significantly relieve the cancer pain of BALB/c nude rats， whose mechanism may be correlated with Ailitong Ointment in inhibiting tumor growth， decreasing NGF and TNF-α contents and increasing β-EP levels.

〔Keywords〕 Ailitong Ointment; cancer pain; tumor necrosis factor alpha; spinal nerve growth factor; beta-endorphin; endothelin-1

癌性疼痛亦稱癌痛，是惡性腫瘤患者最常見亦是最痛苦的癥狀之一，其中包括由腫瘤直接引起的疼痛（如腫瘤壓迫，骨、神經(jīng)、內(nèi)臟、皮膚、軟組織腫瘤浸潤或轉移等）、腫瘤治療引起的疼痛及腫瘤診斷檢測引起的疼痛等。據(jù)國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer， IARC）統(tǒng)計，2018年全球有18 078 957新增癌癥病例，每10萬人群中每年約有237人[1]。癌痛是癌癥患者常見的癥狀之一，有80%的晚期癌癥患者存在癌痛，其中50%的患者為中、重度癌痛，嚴重影響著生活質(zhì)量[2]。我國約25%新診斷的癌癥患者、33%正在接受治療的癌癥患者以及75%的晚期腫瘤患者伴有不同程度的疼痛[3]。然而由于目前治療方法的局限性和治療所帶來的不良反應，仍有20%～40%癌痛患者不能得到滿意的鎮(zhèn)痛治療[4]，因此，積極尋找更安全有效的癌痛治療方法具有重要的意義。癌理通膏是佛山市中醫(yī)院腫瘤中心依據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床治療經(jīng)驗研制的院內(nèi)中藥新制劑，具有活血止痛、化瘀散結、攻毒抗癌之功效。在臨床應用中觀察到癌理通膏有較好的止痛療效，但其作用機制有待進一步研究。本研究通過皮下注射Walker 256乳腺癌細胞的方法建立裸鼠癌痛模型，動態(tài)觀察癌理通膏對裸鼠自發(fā)痛評分和腫瘤體積的影響，同時檢測癌理通膏對腫瘤重量及脊髓神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）、腫瘤壞死因子-α（tumornecrosis factor alpha， TNF-α）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1， ET-1）和β-內(nèi)啡肽（beta-endorphin， β-EP）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 ?材料

28只4～5周SPF級雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量為20～25 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0002，動物合格證號：44007200042979。癌理通膏由佛山市中醫(yī)院制劑中心提供，批號：13316022。Step One QPCR儀（美國Applied Biosystems公司，批號：ABI7500）;Eastep總RNA提取試劑盒（上海Promega公司，批號：promega.ls1040）;反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo公司，批號：K1622）;PCR擴增試劑盒SYBRPremix Ex taqTM（日本Takara公司，批號RR820A）;Walker 256乳腺癌細胞株（Walker/LLC-WRC 256，武漢大學保藏中心，CCTCC編號：GDC060）。引物由上海瑞博生物公司設計合成，序列如表1所示。

1.2 ?動物飼養(yǎng)及分組

BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物房，每籠4只，光照黑暗周期為12 h∶12 h，自由飲食。28只裸鼠接種W256細胞后，待腫瘤長至約50～100 mm3時，篩選腫瘤大小較為均一的荷瘤裸鼠20只，隨機分為模型組、癌理通組，10只/組。

1.3 ?細胞培養(yǎng)

Walker 256乳腺癌細胞培養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心細胞室，于37 ℃、5% CO2的環(huán)境培養(yǎng)。使用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞長至80%～90%滿時，按適當比例接種到培養(yǎng)瓶，對傳代細胞觀察3 d，細胞未見異常，培養(yǎng)液未見異常，該株細胞納入實驗。

1.4 ?模型制備

將Walker 256 細胞株接種于皮下是目前常用的小鼠移植性腫瘤的造模方式[5]。Walker 256細胞株來源于大鼠自然生長的乳腺腫瘤，皮下注射能很好地模擬人惡性腫瘤膨脹性及浸潤性生長的特性[6]，能使大鼠出現(xiàn)痛覺過敏，痛覺超敏和自發(fā)痛等癌痛特征，且成瘤率高，是研究癌痛的良好實驗動物模型[7-8]。本實驗研究參考Sasamura等[9]的方法，Walker 256乳腺癌細胞復蘇后，取對數(shù)生長期的細胞，用PBS制備成1.2×107個/mL濃度的細胞懸液，接種于28只裸鼠大腿外側近臀部處皮下（每只裸鼠200 μL，約2.4×106個細胞）。

1.5 ?給藥方法

按成人等效劑量換算成裸鼠癌理通膏的劑量為61 g/kg，分組當天起癌理通組裸鼠每日按體質(zhì)量稱取適量的癌理通膏，將其置于壓敏膠紙上，再行敷貼至腫瘤處，用透氣膠貼固定，每日敷貼6 h。期間將裸鼠裝至50 mL帶透氣孔的離心管固定，模型組涂抹生理鹽水后同法固定裸鼠6 h，連續(xù)給藥10 d。給藥方法參考劉耀[10]、姜涌[11]的給藥方式。

1.6 ?自發(fā)痛評分

自發(fā)痛評分是通過觀察受試動物行走時后足使用情況對自發(fā)性疼痛行為進行評分的方法[12]。該方法由Mouedden等[13]提出，目前，主要用于骨癌痛模型的評估[14]。分別于敷貼給藥前，敷貼給藥后第3、5、7、10天（記為敷藥前、第3天、第5天、第7天、第10天），將各組裸鼠分別放入40 cm×40 cm的平底觀察盒內(nèi)，根據(jù)裸鼠自發(fā)行走進行評分。評分標準[15]：正常行走得0分，輕度跛行得1分，中度跛行得2分，嚴重跛行得3分，完全殘疾得4分。

1.7 ?測量腫瘤體積及重量

每周測量腫瘤的最長徑（a）、最短徑（b）2次，計算腫瘤體積，計算公式為：V=1/2ab2。計算相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV），計算公式[16]為：RTV=Vt/V0。其中V0為分組時即第一次敷藥前（記為敷藥前）測量所得腫瘤體積，Vt為第t天測量時的腫瘤體積。計算相對腫瘤增殖率：相對腫瘤增殖率=TRTV/CRTV×100%（TRTV：癌理通組RTV;CRTV：模型組RTV）。當相對腫瘤增殖率大于40%時為治療無效;當小于或等于40%時，且與模型組比較，Vt或RTV的差異P<0.05為治療有效。

最后一次自發(fā)痛評分和腫瘤體積測量結束后過量二氧化碳吸入法處死裸鼠，剝離腫瘤稱量重量。計算腫瘤生長抑制率[17]：腫瘤生長抑制率=（模型組腫瘤重量-癌理通組腫瘤重量）/模型組腫瘤重量×100%。當腫瘤生長抑制率小于40%為治療無效;腫瘤生長抑制大于或等于40%為治療有效。

1.8 ?檢測NGF、TNF-α、ET-1、β-EP的基因相對表達量

過量二氧化碳吸入法處死裸鼠后，取脊髓L4-L6腰膨大部分迅速投入液氮凍存后放-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR檢測NGF、TNF-α、ET-1和β-EP的表達。按照Eastep總RNA提取試劑盒說明書操作步驟經(jīng)過裂解、稀釋、靜置、離心、清洗、溶解后提取總RNA并用紫外分光光度計測量RNA濃度，根據(jù)等量加入總RNA的原則計算出應加入總RNA體積并加入到逆轉錄反應體系中（20 μL），將RNA逆轉錄成cDNA。隨后取2 μL cDNA加入PCR擴增反應體系（20 μL）中95 ℃ 30 s擴增40個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s后結束反應。使用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量，即2-ΔΔCT=表達量的比值。

1.9 ?統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均運用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用“x±s”進行統(tǒng)計學描述。計量資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或轉換后服從正態(tài)分布，則組間比較采用獨立樣本t檢驗。數(shù)據(jù)經(jīng)轉換后仍然不服從正態(tài)分布，則組間比較采用非參數(shù)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?自發(fā)痛評分結果

兩組裸鼠的自發(fā)痛評分結果如表2所示，敷藥前至第5天癌理通組與模型組的自發(fā)痛評分差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第7天和第10天癌理通組的自發(fā)痛評分明顯低于模型組（P<0.05）。

2.2 ?腫瘤體積測量結果

如表3-4所示，模型組和癌理通組裸鼠的腫瘤體積在敷藥前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），當連續(xù)給藥至第3、7、10天時，癌理通組裸鼠的腫瘤體積與相對腫瘤體積均明顯小于模型組（P<0.01）。相對腫瘤增殖率為33.30%，低于40%。

2.3 ?腫瘤重量測定結果

癌理通組裸鼠經(jīng)過10 d的貼敷治療，腫瘤重量（2.40±0.79） g明顯小于模型組腫瘤重量（6.53±1.90） g，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;癌理通膏對腫瘤的生長抑制率為63.24%。

2.4 ?脊髓NGF、TNF-α、ET-1、β-EP的基因相對表達結果

與模型組相比，癌理通組脊髓ET-1的基因相對表達量有下降的趨勢（P<0.05），NGF、TNF-α基因相對表達量則明顯下降（P<0.01，P<0.05），β-EP的基因相對表達量則明顯升高（P<0.05）。結果見表4。

3 討論

癌性疼痛是一種機制獨特而復雜的慢性疼痛，腫瘤的生長引起的神經(jīng)壓迫與損傷本身就可導致疼痛狀態(tài)的出現(xiàn)。癌性疼痛屬于中醫(yī)學“痛證”范疇，其病因多樣，病機總歸“不榮則痛”和“不通則痛”兩類，故據(jù)其治則“榮則不痛”“通則不痛”確立化瘀、祛痰、散寒、解毒為其常用治法。癌理通膏由制馬錢子、蟾酥、毛麝香、徐長卿、金牛皮、冰片6味中藥組成，具有活血止痛、化瘀散結及攻毒抗癌之功效。為了明確癌理通膏對癌性疼痛的治療作用和可能機制，本研究團隊動態(tài)觀察了癌理通膏對癌性疼痛模型裸鼠的自發(fā)痛評分和腫瘤大小的影響，發(fā)現(xiàn)隨著天數(shù)的增加，裸鼠的腫瘤體積增大，自發(fā)痛評分逐漸升高。從第3天起癌理通組的腫瘤體積和腫瘤相對體積均已明顯低于模型組，自發(fā)痛評分從第7天起明顯低于模型組，癌理通組的腫瘤重量亦明顯低于模型組，對腫瘤的生長抑制率高達63.24%，說明癌理通膏能明顯減輕癌性疼痛，抑制腫瘤的生長。

除腫瘤本身生長能引起的疼痛外，腫瘤生長所引起的TNF-α、ET-1、NGF、β-EP等的合成與釋放也是癌痛的原因之一。NGF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，該家族是對周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)起營養(yǎng)和支持作用的調(diào)節(jié)因子，不僅參與神經(jīng)的發(fā)育和存活，還參與痛覺敏感性的調(diào)制。有學者研究發(fā)現(xiàn)[18]胰腺癌患者的疼痛程度和NGF的含量成正相關。McCaffrey等[19]在小鼠骨肉瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)NGF阻滯能減輕40%～70%的癌痛，并且這種作用在動物模型的晚期仍然有效，此外在乳腺癌、肉瘤、前列腺癌骨轉移的小鼠模型中，使用NGF抗體均能明顯減輕骨癌疼痛。證明NGF的含量上調(diào)是疼痛發(fā)生的重要機制。本研究發(fā)現(xiàn)癌理通膏能明顯降低裸鼠脊髓NGF的水平，這可能是癌理通減輕癌痛的機制之一。

TNF-α和ET-1均屬重要的炎性介質(zhì)，TNF-α是由脂多糖刺激巨噬細胞而分泌的一種具有多種生物活性的炎性細胞因子，可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生，介導腫瘤細胞壞死，也是外周和中樞痛敏的重要參與因子之一[19-20]。TNF-α不僅可直接作用于疼痛感受器并誘發(fā)其他生物學反應（如炎癥、凋亡、免疫應答等），還能增加其他致痛物質(zhì)，如P物質(zhì)、緩激肽、前列腺素E2等的致痛作用，此外還能刺激神經(jīng)末梢改變神經(jīng)元的興奮性，并產(chǎn)生機械疼痛和誘發(fā)痛覺過敏[21-22]。研究表明促炎細胞因子TNF-α表達升高能明顯促進神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展，而阻斷TNF-α信號通路能明顯減輕癌痛，可能是癌痛治療的重要靶點[23-24]。ET-1是一種小分子生物活性肽，具有多種生物活性，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也有密切聯(lián)系。ET-1不僅能通過激活神經(jīng)元上相應的受體，介導疼痛的發(fā)生，還能影響癌痛的程度，而使用ET-1受體拮抗劑又可阻斷痛覺過敏的發(fā)生[25]。有研究[26]提出通過研究40例癌癥患者的爆發(fā)痛情況發(fā)現(xiàn)，血漿ET-1濃度與爆發(fā)痛呈顯著正相關。本研究對比癌理通組和模型組脊髓中TNF-α、ET-1的表達發(fā)現(xiàn)，癌理通膏有降低ET-1表達的趨勢，能明顯降低裸鼠脊髓TNF-α的表達，提示癌理通膏減少癌痛的發(fā)生可能與降低TNF-α的含量從而減輕炎癥反應有關。

與NGF、TNF-α和ET-1在癌痛的發(fā)生過程中能起到引發(fā)、促進的作用不同，β-EP是機體產(chǎn)生的具有鎮(zhèn)痛作用的主要內(nèi)源性阿片肽，鎮(zhèn)痛作用部位主要在脊髓以上水平，其濃度可影響患者的痛閾值[27]。研究發(fā)現(xiàn)β-EP可以抑制早期胰腺癌小鼠模型的內(nèi)臟痛[28];在電針治療小鼠癌痛模型的研究中發(fā)現(xiàn)，未做任何干預的癌痛小鼠血和腦中β-EP的濃度比空白對照組高2倍[29]。這些研究均提示β-EP在癌痛中具有重要的止痛作用。本研究發(fā)現(xiàn)癌理通組脊髓中β-EP的含量明顯高于模型組，表明癌理通膏的鎮(zhèn)痛作用可能與提高脊髓中β-EP的含量有關。

綜上所述，癌理通膏對Walker/LLC-WRC 256荷瘤裸鼠因腫瘤引起的自發(fā)痛有明顯的改善作用，其作用機制可能與抑制腫瘤生長、降低脊髓NGF和TNF-α的表達，升高脊髓β-EP的表達有關。

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