結直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin 的表達及臨床意義

張敏，馮怡錕，張巖，付文靜，常佳，任景麗

鄭州大學第二附屬醫院病理科，鄭州 450000

結直腸腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，居惡性腫瘤死亡原因的第二位，且近年來其發病率呈明顯上升趨勢，嚴重危害人類生命健康[1]。盡管以手術為主，結合放射治療、化學治療和生物治療等的綜合治療在臨床取得了一定進展，但結直腸腺癌的5年生存率仍為50%～60%，伴遠處轉移的結直腸腺癌患者預后更差[2]。侵襲和轉移仍然是導致患者預后不良的關鍵性因素，其轉移的潛在性通常難以預測。結直腸腺癌的侵襲和轉移是一個包括腫瘤細胞黏附、運動、基質降解和新生血管生成等多方面的復雜過程[3]。近年的研究表明，多種生物學指標與結直腸腺癌的發生、發展、復發、轉移及預后密切相關[4]。基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）是基質金屬蛋白酶家族成員之一，能夠降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和基膜（basement membrane，BM），促進腫瘤細胞向周圍組織擴散，從而對腫瘤的侵襲和轉移產生影響[5]。ADAM金屬肽酶域17（ADAM metallopeptidase domain 17，ADAM17）是ADAM蛋白家族的成員之一，又名腫瘤壞死因子-α轉化酶（tu-mor necrosis factor-alphaconverting enzyme，TACE），已發現在多種腫瘤中均有高表達，對腫瘤的發生、發展有重要作用[6]。E鈣黏蛋白（E-cadherin）作為重要的黏附分子，其低表達對于腫瘤發展具有重要作用[7]。本研究采用免疫組織化學染色技術，檢測結直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin的表達情況，并與腺瘤及正常結直腸黏膜組織進行對比，探討其在結直腸腺癌發生及發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年7月至2018年10月鄭州大學第二附屬醫院確診的結直腸腺癌患者的病歷資料。所有患者均有詳細的臨床資料和手術記錄，且術前均未進行放、化療，所有標本均經蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色篩選。共納入120例結直腸腺癌患者作為結直腸腺癌組，其中男66例，女54例；年齡37～77歲，平均（60.33±12.14）歲；腫瘤直徑：＜3 cm 56例，≥3 cm 64例；分化程度：高分化26例，中分化67例，低分化27例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期42例；有淋巴結轉移50例，無淋巴結轉移70例；有漿膜浸潤58例，無漿膜浸潤62例。從中選取30例患者作為正常結直腸黏膜組，其中男19例，女11例；年齡40～77歲，平均（59.41±11.63）歲。另取56例行同期手術切除和纖維結腸鏡活檢的結直腸腺瘤患者作為結直腸腺瘤組，其中男 31例，女 25例；年齡 39～75歲，平均（58.17±10.48）歲。3組研究對象性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。分別取結直腸腺癌組、正常結直腸黏膜組[結直腸腺癌標本陰性殘端處（據腫瘤邊緣大于15 cm，且無壞死）相對正常的結直腸黏膜（病理證實）]、結直腸腺瘤組患者的相應組織標本。

1.2 實驗試劑

兔抗人MMP2、ADAM17及E-cadherin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，PⅤ-9000二抗試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液均購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學法檢測MMP2、ADAM17及E-cadherin 蛋白表達情況

參照PⅤ-9000試劑盒說明書對組織蠟塊進行常規脫蠟、水化、枸櫞酸鹽抗原熱修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，滴加一抗，4℃過夜；采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次2 min，滴加MMP2、ADAM17及E-cadherin一抗。在4℃下孵育過夜。用PBS沖洗3遍，每次2 min，加入二抗，在室溫下孵育20 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色。蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。用已知的結直腸腺癌陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

由兩名受過專業培訓的臨床病理科醫師獨立閱片，MMP2、ADAM17陽性表達為腫瘤細胞質黃棕色著色，E-cadherin陽性表達為細胞膜/細胞質黃棕色著色。于高倍鏡（400倍）下隨機選取10個視野，依據以下準則判定陽性表達。①染色程度：0分，無色；1分，淺黃色；2分，黃色；3分，棕黃色。②陽性細胞所占百分比：0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。陽性強度為兩種計分方式評分之和：0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～5分為陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中MMP2、ADAM17及cadherin陽性表達情況的比較

結直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17陽性表達率均高于結直腸腺瘤組織和正常結直腸黏膜組織，E-cadherin陽性表達率低于結直腸腺瘤組織及正常結直腸黏膜組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征的結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及cadherin陽性表達情況的比較

不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移、漿膜浸潤結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中MMP2陽性表達率比較，差異均有統計學 意 義（χ2=5.27、19.71、13.43、13.17、5.93，P＜0.05）。不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移、漿膜浸潤結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中ADAM17陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=10.51、17.11、11.66、13.38、8.50，P＜0.05）。不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移、漿膜浸潤結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中E-cadherin陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=4.42、2.41、8.48、6.59、7.05，P＜0.05）。不同年齡、性別的結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17、E-cadherin陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin的陽性表達情況（n=120）

3 討論

侵襲和轉移是腫瘤最本質的特征之一，也是導致腫瘤患者死亡的主要原因之一，它是一個多環節、多步驟的腫瘤細胞與宿主細胞相互作用的連續過程，包括腫瘤細胞從原發灶脫離、侵犯周圍組織、進入循環系統、逃避免疫監視、血管形成以及在遠隔器官形成轉移灶等[8]。MMP是降解細胞外基質的主要家族之一，而MMP2是MMP家族中分布最廣的成員，屬于明膠酶類，可作用于Ⅳ型膠原。既往研究顯示MMP2在多種腫瘤組織中表達量顯著高于相應正常黏膜組織，提示MMP2與腫瘤的發生發展相關，并指出了為腫瘤干預治療而對MMP2進行相關研究的重要性[9]。在本研究中，MMP2在結直腸腺癌組織中的陽性表達率均高于直腸腺瘤組織及正常結直腸黏膜組織；而對于結直腸腺癌患者，腫瘤直徑越大、組織分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴結轉移及漿膜浸潤者MMP2陽性表達率越高，說明MMP2與結直腸腺癌的惡性程度有關，可以降解ECM和BM，從而促進腫瘤轉移。高雙英等[10]研究顯示，當細胞惡變時常伴隨著MMP2表達的增高，在部分腫瘤中還發現隨著腫瘤惡性程度的增高，MMP2的表達也增高，且與腫瘤的浸潤和轉移相關，與本研究結果一致。

ADAM17是ADAM家族成員之一，最初被認為是TNF釋放酶而被發現，其功能多樣，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中均有表達[11]。本研究發現，相比較于結直腸腺瘤組織及正常結直腸黏膜組織，結直腸腺癌組織中ADAM17陽性表達率升高，對ADAM17表達與結直腸腺癌臨床特征的分析顯示ADAM17高陽性表達率與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及漿膜浸潤有關，提示ADAM17的表達與結直腸腺癌的發生、發展及轉移有關。此結果與乳腺癌的研究結果類似，ADAM17抑制劑通過抑制表皮生長因子受體配體的釋放，減少表皮生長因子反應性乳腺癌細胞的生長速率及轉移持續性[12]。有關ADAM17參與腫瘤侵襲及轉移的機制尚未明確，由于腫瘤的發生、發展是多基因、多步驟的相互作用過程，包括惡性腫瘤從原發灶脫離、穿過ECM和BM，穿過血管壁進入宿主微環境等步驟[13]。ADAM17可能在腫瘤發生發展的多個環節通過參與不同調節途徑發揮了作用。相關研究證實ADAM17能通過調節細胞使其黏附于相鄰細胞及ECM，這可能是腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移的起始步驟[14]。ECM和BM的降解是腫瘤轉移的必要步驟，ECM的降解需要專一的蛋白水解酶的作用，而ADAM17被證明是這一蛋白水解酶的類似物，其高表達能產生類似的降解作用，從而破壞ECM屏障促使腫瘤細胞發生轉移[15]。

E-cadherin是一類介導同型細胞相互黏附的跨膜糖基質蛋白質，在機體的胚胎組織、成熟組織的上皮細胞和增生活躍的上皮細胞中高表達，其自身除了可以調節胚胎組織的發育、上皮組織的形成、細胞間物質和信息的傳遞交流外，還對促進細胞間黏附、保持上皮形態和結構功能的完整性有重要價值[16]。研究顯示，E-cadherin表達下調或出現功能改變時，會導致腫瘤細胞間的黏附性下降，從而脫離原病灶，并具有發生侵襲的可能，此時腫瘤細胞易于從原病灶脫落分離，向淋巴結或遠處轉移[17]。本研究結果顯示，E-cadherin表達與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及漿膜浸潤有關，提示E-cadherin與結直腸腺癌的發生發展及轉移有關。結直腸腺癌在發展過程中，伴隨著緊密連接的破壞、黏附力的下降，引起腫瘤細胞侵襲能力的增加，使腫瘤細胞脫離原發灶，容易通過淋巴管或血管發生遠處轉移。而當細胞黏附缺失使組織結構的完整性受到破壞后，可使細胞間變得松散，腫瘤細胞易脫落，導致腫瘤細胞擴散轉移。

目前腫瘤的治療越來越傾向于個體化，而個體化的治療依賴于準確的術前診斷和評估。本研究證明MMP2、ADAM17隨結直腸腺癌癌變程度、浸潤程度加深及淋巴結轉移的出現，陽性表達率升高；E-cadherin隨結直腸腺癌癌變程度、浸潤程度加深及淋巴結轉移的出現，陽性表達率降低。這提示MMP2、ADAM17過表達及E-cadherin缺失可能引起腫瘤侵襲轉移能力增強。因此，綜合分析上述3項指標，可為結直腸腺癌患者臨床診斷、預后判斷及個體化治療提高理論依據，具有臨床應用價值。