熒光定量PCR法和免疫膠體金法對(duì)沙眼衣原體的檢測(cè)效果對(duì)比分析

劉小琳，楊 浩，任天鳳 (信宜市婦幼保健院，廣東 信宜 525300)

沙眼衣原體(CT)為性傳播疾病的主要病原體，目前我國CT感染呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，其根本原因是CT感染后抗生素使用不合理所導(dǎo)致的，前列腺炎、附睪炎、尿道炎是男性CT感染后的主要癥狀，而子宮內(nèi)膜炎、宮頸炎、盆腔炎是女性CT感染后的主要癥狀，部分患者還會(huì)出現(xiàn)肛周炎、異位妊娠、不孕癥等并發(fā)癥，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響[1]，因此，及早、快速、準(zhǔn)確地診斷CT感染對(duì)于其治療和改善預(yù)后具有積極意義。傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法有涂片、培養(yǎng)、免疫學(xué)等技術(shù)，其檢出效果差，需要的時(shí)間長，增加了臨床診斷的難度[2]。近年來，隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，膠體金標(biāo)法和熒光定量PCR法已成為臨床上廣泛用于檢測(cè)CT感染的方法，但其靈敏度和特異度各不相同[3-4]，本文旨在對(duì)比分析熒光定量PCR法和免疫膠體金技術(shù)對(duì)信宜地區(qū)沙眼衣原體的檢測(cè)效果，為今后臨床選擇合適的方法檢測(cè)CT感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2020年5月信宜地區(qū)180例疑似沙眼衣原體感染患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：信宜地區(qū)戶籍或在信宜地區(qū)常住3年以上的人群，簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能異常，心腦血管異常，精神障礙，心理障礙，傳染病史，凝血功能障礙患者。其中男67例，女113例，年齡21～32歲，平均(28.34±5.21)歲，細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果顯示：陽性170例，陰性10例。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2標(biāo)本采集：設(shè)備：上海宏石提供的 SLAN-96S 熒光定量 PCR儀。

樣本采集：男性：對(duì)尿道局部皮膚全面消毒，反轉(zhuǎn)包皮，使用專用的拭子采集標(biāo)本，若取樣尿液則首先清洗包皮后留取樣本；女性：局部皮膚全面消毒，將棉拭子插入患者尿道約2 cm深度，若是外陰病灶則使用棉拭子提取周圍分泌物，陰道分泌物也采用相同的方法留取。每位患者留取3份樣本，分別用于細(xì)菌培養(yǎng)、熒光定量PCR檢測(cè)、免疫膠體金標(biāo)法檢測(cè)。

檢測(cè)試劑：沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑[生產(chǎn)廠家：艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第3400386號(hào)]，沙眼衣原體核酸檢測(cè)試劑(生產(chǎn)廠家：廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國械注準(zhǔn)20143401937)。

熒光定量PCR法：EP管中加入無菌生理鹽水1 ml并搖勻，伸入采集管底部吸取臨床樣本0.8 ml加入1.5 ml離心管中；13 000 r/min離心90 s，棄上清(可保留殘液約20 μl)。加入0.5 ml細(xì)胞保存液振蕩重懸細(xì)胞，13 000 r/min離心90 s，盡量去盡全部上清。每樣本加入50 μl細(xì)胞裂解液，充分振蕩重懸細(xì)胞，煮沸10 min。13 000 r/min離心10 min，取上清(上清為釋放的DNA)2 μl作為PCR擴(kuò)增模板，加入反應(yīng)試管(含PCR反應(yīng)液)中，設(shè)定陰性對(duì)照和陽性對(duì)照各一管，設(shè)定PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增結(jié)束分析軟件自動(dòng)分析，陽性：CT值>37。

膠體金法：根據(jù)沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑[生產(chǎn)廠家：艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第3400386號(hào)]說明書實(shí)施檢測(cè)，裂解樣本獲取沙眼衣原體抗原，將裂解后含有抗原的溶液滴入加樣孔內(nèi)，20 min后讀取結(jié)果，陽性：測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶。

培養(yǎng)法：以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)方法如下：采用McCoy 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，從-80℃的冰箱中取出標(biāo)本，并將其放置在37℃水浴箱中，取0.2 ml接種在McCoy 細(xì)胞上，離心60 min后取出放置在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中2 h將上清液去除，重新加入1 ml衣原體生長培養(yǎng)基并放置在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)板取出，烘干后加入甲醇固定15 min，碘染色后將其倒置在顯微鏡下觀察McCoy 細(xì)胞胞漿內(nèi)形成的衣原體包涵體，陽性：≥2個(gè)包涵體/孔。

1.3觀察指標(biāo)：以細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光定量PCR法、膠體金標(biāo)法檢測(cè)沙眼支原體的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度及Kappa值，并進(jìn)行比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，熒光定量PCR法診斷CT感染的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度、Kappa值顯著高于免疫膠體金法，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩種方法檢測(cè)CT感染特異度、陽性預(yù)測(cè)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 兩種方法檢測(cè)沙眼衣原體效果比較(%)

表2 兩種方法檢測(cè)沙眼衣原體效果比較[n(%),n=180]

3 討論

近年來沙眼衣原體(CT)感染的患者逐年上升，受到全球的廣泛重視，截至2020年全球新發(fā)感染CT患者達(dá)到3億，生殖道沙眼衣原體感染逐漸升高[5]。無癥狀CT感染患者中男性與女性比例為3∶7，若不能及時(shí)診斷和治療極易發(fā)生逆行感染，男性出現(xiàn)前列腺炎、附睪炎、不育癥，而女性極易發(fā)生輸卵管炎、盆腔炎，妊娠期婦女容易流產(chǎn)、死胎，因此，對(duì)于CT感染應(yīng)及早診斷并給予有效的治療[6]。沙眼衣原體是臨床上常見的泌尿生殖道感染的病原體，免疫膠體金法、涂片法、細(xì)菌培養(yǎng)法是目前臨床上常用的檢測(cè)方法，其中細(xì)菌培養(yǎng)法是臨床上公認(rèn)的檢測(cè)CT感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法時(shí)間長，而常用的方法敏感性差、可靠性差也不能為臨床上治療提供重要的依據(jù)，限制了其在臨床上應(yīng)用[7]。

熒光定量PCR法可對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，雜交特異分子，其結(jié)合了化學(xué)熒光發(fā)光法，在封閉的環(huán)境中進(jìn)行，可通過計(jì)算機(jī)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)和自動(dòng)化檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確度，還能縮短檢測(cè)的時(shí)間[8]，隨著熒光定量PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，其被廣泛應(yīng)用在基因檢測(cè)中，并且在增加基因產(chǎn)物后該方法的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，因此，每次循環(huán)后需要進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集，從而獲取熒光擴(kuò)增曲線，進(jìn)而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度[9]。本研究顯示，熒光定量PCR法檢測(cè)CT感染的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度、Kappa值顯著高于膠體金標(biāo)法，說明熒光定量PCR法檢測(cè)CT感染的準(zhǔn)確性更高，當(dāng)標(biāo)本中衣原體抗原含量較低的情況下，此時(shí)采用免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)可能會(huì)呈現(xiàn)假陰性，靈敏度較低，而熒光定量PCR法檢測(cè)的效果則不受抗原含量的影響，樣品中即使存在極低含量的病原體基因，熒光定量PCR法也可以通過擴(kuò)增檢測(cè)到。免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)CT感染反映的是機(jī)體對(duì)于CT的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不能判定是既往感染還是當(dāng)前感染，而熒光定量PCR法則能夠真實(shí)的反映CT的存在和目前的繁殖程度，可有效判斷目前CT是既往感染還是現(xiàn)癥感染，為臨床治療方案的制訂提供依據(jù)[10]。熒光定量PCR法和免疫膠體金技術(shù)對(duì)于CT感染的檢測(cè)各自存在優(yōu)缺點(diǎn)，但是熒光定量PCR技術(shù)操作時(shí)間短及檢測(cè)時(shí)間更短，靈敏度、準(zhǔn)確度更高，并且熒光定量PCR法可對(duì)病原體進(jìn)行定量檢測(cè)，不但能夠提高診斷的價(jià)值，還可用于流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)與調(diào)查[11]。

綜上所述，與免疫膠體金法相比，熒光定量PCR法檢測(cè)CT感染的效果更優(yōu)，不但縮短時(shí)間，便于操作，還可提高檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度，為臨床診治提供有效依據(jù)。