PD-1在4NQO誘導的小鼠口腔黏膜鱗狀細胞癌中表達變化

張柏林，李 巖，朱雪琴，蔣英英，，陳萬濤

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是全球范圍內重要的致死性頭頸惡性腫瘤之一[1-2]。傳統治療方法往往存在預后效果差、臨床易復發等多種問題。免疫治療作為一種新型的腫瘤治療手段，療效持久，不良反應低，對多種腫瘤治療效果顯著，受到國內外廣泛關注。目前，程序性死亡蛋白1及其配體(programmed cell death1/programmed cell death 1 ligand，PD-1/PD-L1)和細胞毒性T淋巴細胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)是免疫檢查點領域中的研究熱點[3-5]。PD-1單抗藥物在治療黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中也取得了顯著效果[6]。近期臨床試驗表明，PD-1對頭頸部鱗癌術后復發與轉移的治療也表現出令人滿意的療效，且安全性和耐受性良好，但關于PD-1與口腔黏膜鱗癌發展進程的研究少有報道[7]。本研究旨在探討免疫檢查點PD-1與小鼠口腔黏膜鱗癌發展的相關性，為口腔黏膜鱗癌的免疫治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要儀器

C57BL/6(H-2b)成年野生型小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)購自美國Sigma公司，FITC Anti-Mouse CD4、APC Anti-Mouse CD279(PD-1)均購自美國BD公司，PrimescriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM均購自日本Takara公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。流式細胞儀購自美國FACSCaliburBD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠口腔鱗癌模型建立 本研究綜合相關文獻報道與實驗室前期研究結果，取8～10周齡成年野生型小鼠10只，隨機分為實驗組和對照組兩組，每組各5只。實驗組小鼠在飲水中加入100 mg/L的4NQO，飼喂20周(每周更換1次)后換成正常飲水；對照組小鼠給予正常飲水。28周后模型誘導結束[8-9]。處死、解剖小鼠，取舌、脾組織，10%甲醛溶液固定，組織病理切片、HE染色，顯微鏡下觀察并比較其病理變化。實驗組小鼠口腔鱗癌誘導成功率100%；對照組小鼠均無口腔鱗癌發生。

1.2.2 實時逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 取實驗組小鼠5只舌部病變黏膜組織，對照組小鼠5只舌部相同位置黏膜組織，研磨，加入1 mL TRIzol，提取總RNA。經紫外分光光度儀檢測A260/A280比值，驗證RNA純度和濃度。根據試劑盒說明書合成cDNA，進行Real-time PCR。反應體系如下：SYRB Green Master mix 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，補水至 20 μL。反應條件為：預熱；95 ℃，35 s變性，60 ℃ 34 s退火延伸，42次循環。每個樣本重復3次。用2-ΔΔCt法計算相對值用于數據統計與分析。所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物

1.2.3 流式細胞術 取實驗組、對照組小鼠各3只，將小鼠安樂死后，取出舌部病變組織、脾臟、引流淋巴結2對，制成組織單細胞懸液。每個樣本取2×106個細胞行流式細胞術，加入50 μL CD4-FITC和PD-1-APC流式抗體混合液，冰箱避光染色15 min，加入400 μL PBS溶液，高速離心后棄上清，加入250 μL PBS溶液重懸，將樣本轉移到流式管中上機檢測，在流式細胞儀控制軟件中圈門選出CD4+T細胞群，檢測其PD-1的平均熒光強度。

1.2.4 數據統計與分析 流式數據采用Novoexpress軟件進行分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件對Real-time PCR數據進行作圖與分析，組間樣本均數的統計學分析采用t檢驗法，P<0.05差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 成功建立小鼠口腔鱗癌模型及組織病理學評價

在成年小鼠的飲水中加入100 mg/L濃度的4NQO，飲水暴露20周后，觀察到28周，成功誘導小鼠發生口腔鱗癌(圖1A)。處死小鼠后，取舌組織和脾臟組織用于后續研究。形態學結果顯示：對照組小鼠舌背黏膜呈粉紅色，富有彈性，舌乳頭分布均勻，舌體柔軟，無白斑樣改變；4NQO組小鼠舌背黏膜粗糙不平，廣泛白色斑塊樣改變，可見數個白色外生性腫物，表面光滑，未見潰瘍和壞死舌。4NQO組小鼠脾臟色暗紅，充血，體積明顯小于對照組小鼠(圖1B)。組織病理學結果顯示：對照組小鼠舌背黏膜上皮為角化的復層鱗狀上皮，層次清楚，細胞排列正常，未發現上皮異常增生等變化，上皮和肌層之間為薄層結締組織，無明顯炎細胞浸潤；4NQO組小鼠舌背病變組織呈外生性生長，棘層可見癌細胞團，細胞及核異形性明顯，核分裂像明顯，基底層完整，腫瘤細胞未發生基底下浸潤，上皮與基層之間可見炎細胞浸潤。對照組小鼠脾臟白髓、紅髓清晰可見，界限明顯，紅髓分布于白髓及邊緣區的外側，邊緣區結構清晰，把白髓和紅髓間隔開；淋巴細胞染色呈深藍色；4NQO組小鼠脾臟白髓減少或消失，紅髓、白髓界限模糊，淋巴細胞染色呈深藍色，廣泛浸潤，數量增多(圖1C)。

A：小鼠口腔鱗癌模型的建立; B：小鼠舌部、脾臟形態學改變(箭頭示); C：小鼠舌黏膜病變組織內可見癌細胞團，脾臟白髓結構改變(箭頭示，HE染色)

2.2 PD-1在小鼠口腔黏膜鱗癌發生后表達明顯升高

成功誘導小鼠產生口腔鱗癌后，取小鼠舌部病變組織，利用Real-time PCR檢測病變組織中PD-1、PD-L1基因的mRNA表達，結果顯示，4NQO誘導組小鼠PD-1的mRNA表達量明顯高于對照組小鼠(圖2A)。取小鼠的舌病變組織、脾臟、引流淋巴結等組織，制成單細胞懸液，利用流式細胞術檢測CD4+T細胞中PD-1的表達。結果顯示，4NQO誘導組小鼠舌黏膜病變組織、脾臟和引流淋巴結組織中CD4+T細胞PD-1平均熒光強度均明顯高于對照組小鼠(圖2B)。

A：對照組和4NQO組小鼠PD-1、PD-L1 mRNA的表達(*：P<0.05)；B：對照組和4NQO組小鼠舌黏膜組織、脾臟、引流淋巴結PD-1的變化

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一。據統計，口腔鱗癌患者經過手術、放療和化療為主的綜合治療后，其5年生存率為60%左右，而晚期患者5年生存率僅為20%～40%[10-12]。根據腫瘤細胞免疫應答反應的原理，腫瘤微環境中的樹突狀細胞在識別并捕捉具有腫瘤特異性抗原的癌細胞后，遷移至引流淋巴結，使T細胞活化，經外周血從淋巴結遷移至腫瘤部位，在識別具有腫瘤抗原的癌細胞后繼續發揮殺傷作用，使腫瘤細胞釋放出更多的抗原形成一個“免疫循環”，直至徹底清除腫瘤[13]。T細胞的活化可被負向調控分子抑制，這些負向調控分子被證實是免疫治療的“檢查點”，具有調控T細胞初級應答與二次應答的作用，而抑制此類“檢查點”蛋白(PD-1、CTLA-4)的活性，臨床治療多種腫瘤效果顯著，但具體調控的分子機制仍需深入探討[14-16]。因此，研究免疫檢查點在腫瘤發生發展過程中的表達，對臨床診斷與治療腫瘤具有重要參考價值。

本研究應用經典化學致癌劑4NQO誘導小鼠口腔黏膜腫瘤的發生[17-18]。課題組前期研究發現，4NQO飲水暴露16周后換成正常飲水再飼養8周，80%以上的小鼠舌部發生外生性腫瘤[9]。因此，本實驗選擇100 mg/L濃度的4NQO飲水暴露20周后更換正常飲水再飼養8周，與對照組小鼠相比，4NQO組小鼠的舌背黏膜出現多個外生性腫物，組織病理學結果顯示，模型建立成功。已有研究發現，舌癌患者的腫瘤組織出現大量T淋巴細胞和腫瘤相關巨噬細胞浸潤，并且PD-1表達顯著升高，但研究結果僅在組織中利用免疫熒光法粗略展現，存在一定的局限性[19]。本研究基于健康小鼠和4NQO誘導小鼠，檢測PD-1在舌部病變腫瘤組織、引流淋巴結、脾臟的變化，闡明PD-1在口腔鱗癌發生后的變化，具有重要的參考價值。對頭頸腫瘤基因表達譜的研究發現，該種疾病患者的基因組存在高突變性，其中PI3K信號通路分子具有最高的突變率，其中PIK3CA分子是該信號通路突變率最高的基因[20]。Pik3ca基因的突變將引起AKT2、RICTOR、RAPTOR、TSC1/TSC2的表達改變，進而導致PI3K及其下游信號AKT/mTOR信號通路活化[21]。目前PI3K/AKT/mTOR相關信號抑制劑作為治療頭頸腫瘤的新藥已獲得FDA批準上市，但治療機制仍不十分明確，可結合PD-1抗體探究2種藥物的協同作用和治療效果，具有應用前景。

綜上所述，本研究檢測了PD-1在小鼠發生口腔鱗癌時的變化，發現與正常小鼠相比，在舌黏膜腫瘤組織、引流淋巴結、脾臟中PD-1的表達顯著升高，為口腔鱗癌免疫治療的研究提供實驗依據，對臨床具有一定的參考價值。