基于全基因組RNA測序探索糖尿病周圍神經病變的發病機制

劉旖

【摘要】目的 通過對GEO數據庫的糖尿病周圍神經病變（DPN）、糖尿?。―M）和正常人的血液全基因組RNA 數據集富集分析，探討DPN的發病機制。方法 對GSE95849芯片的數據進行GSEA分析。結果 與正常組相比，DPN中有12637個基因高表達，9200個基因在DM中高表達，DPN相比起DM有13630（67.6% ）個基因表達上調;有32個基因集參與了DPN的發生，4個基因集涉及DM的發病。結論 NF-kB信號通路、轉化生長因子-β信號、未折疊蛋白反應、P53、缺氧因子可能與DPN的發病有關，而β細胞、KRAS蛋白信號可能涉及DM的發生。

【關鍵詞】DPN;GEO;GSEA

糖尿病（DM）已成為全球第七大死因。DM會導致100多種并發癥。臨床發現[1]，30%～40%的DM患者至少會發生一種并發癥。DM并發癥包括心血管病變，神經病變，視網膜病和腎病等。其中，神經病變可累及中樞神經及周圍神經，后者尤為常見。研究顯示[2]，1型DM患者（T1DM）的神經病變率為66%，2型DM（T2DM）為59%。糖尿病周圍神經病變（DPN）已經成為最嚴重的DM并發癥。

慢性高血糖是引發DPN的主要因素。實驗證明[3]T1DM患者在治療血糖后DPN發病率降低。也有研究發現[4]血糖控制良好的T2DM依然發展為DPN。說明高血糖是引起DPN的關鍵因素，但只從宏觀角度去控制血糖不足以改善DPN，需要更多地從基因表達的微觀途徑探討。研究DPN的功能表達譜有助于開展精準治療。而全基因組表達組學分析能為DPN的分子機制提供新的見解。

本研究利用GEO數據庫里的女性DPN、DM和健康者的全基因組表達數據開展GSEA富集分析，分析基因表達差異，探討DPN的功能通路，為DPN的精準治療提供一定的分子依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在GEO數據庫中以關鍵詞“Diabetic Neuropathy”搜索發現GSE95849芯片數據為研究對象。該芯片包括18例研究對象（6例女性DPN，6例DM，6例健康者）的血樣全基因組的總RNA信息。 。

1.2 數據預處理

對探針信號值進行歸一化處理，若有多個探針對應同個基因的，對信號值求取中位數作為唯一表達值。根據Gene Symbol將探針轉換為基因名稱。

1.3 GESA富集分析

利用該18例研究對象的全血總RNA測序信息，按照DPN、DM和正常組，用Hallmark庫進行注釋，進行GSEA富集分析，置換類型為gene sets，置換檢驗次數為1000次，探索DPN和DM在表達水平與哪些特定生物學意義的基因集有顯著關聯。以校正后的歸一化的富集得分（NES）絕對值>1，標化顯著性水準P<0.05，校正多重假設檢驗FDR<0.25的富集結果為有統計學意義。

2 結 果

2.1 差異表達篩選

如表1，12637（62.7%）個基因在DPN患者中高表達，7512（37.3%）個基因在正常組中高表達，DPN患者與正常組的信噪比值約為1.85：1（64.9%;35.1%）。

9200（45.7%）個基因在DM患者中高表達，10949（54.3%）個基因在正常組中高表達，DM患者與正常組的信噪比分值各為35.9%和64.1%。

而與DM患者相比，有13630（67.6%）個基因在DPN中表達更高，6519（32.4%）個基因在DM患者中表達更高，DNP患者和DM患者的信噪比大小分別是77.5%和22.5%。

2.2 GSEA功能富集分析

與正常組相比，共有32個基因集參與了DPN的發生。9個基因集在FDR<0.25時顯著富集，差異有統計學意義（P<0.01），3個基因集達到富集標準。差異有統計學意義（P<0.05），有8個基因集達標。其中，參與程度排前的基因集涉及NF-kB信號通路（圖1A）、轉化生長因子-β信號通路（圖1B）、未折疊蛋白反應、P53通路、缺氧因子、細胞頂端連接和UV誘導反應上調分子功能。

DM患者有4個基因集富集。在FDR<0.25和P<0.05時分別有1個基因集顯著富集。基因富集顯著的分子機制與β細胞、KRAS蛋白信號等功能有關。

3討 論

超過50%的DM患者都可能發展為DPN，DPN患者下肢疼痛麻木甚至感覺喪失，嚴重影響生活質量。研究DPN的分子機制，有助于靶點治療。而生物信息學分析，可幫助研究者在大量遺傳表達信息中更精準地定位有意義的研究方向。

本研究通過GSEA富集分析發現DPN和DM的分子通路都與免疫功能相關。由于神經組織的高度氧化應激敏感，線粒體在高糖環境中產生大量活性氧， 激活NF-kB，誘發炎癥反應或細胞凋亡，最后導致神經損傷。劉紅梅[5-6]發現，血糖波動的DM大鼠的DPN病情比持續高糖的DM大鼠更嚴重，NF-kB表達量也是該組大鼠最高，這與氧化應激水平升高會導致神經超微結構病變及傳導功能受損一致的觀點一致，說明血糖波動可能增加NF-kB。研究發現[7-8]治療DPN的關鍵是通過抑制NF-Kb通路。高血糖引起的線粒體功能障礙和ROS的產生也是DPN的可能病因。研究發現[9]缺氧誘導因子1α（HIF1α）信號傳導受損會導致DM小鼠早期感覺喪失。說明HIF1α是周圍感覺神經元中ROS的上游調節劑，并通過限制ROS水平和誘導VEGF的表達來抑制高血糖引起的神經損傷。但是，這些功能分子與DPN的關系都只是在動物模型上論證，人群患者的推廣性受到限制。作為補充，本研究的結果從人群DPN的角度揭示了NF-Kb信號通路在其中參與的可能性。

研究[10]提出：內質網應激可能導致DPN，而未折疊的蛋白反應能降低DPN的發生。有研究[11]建議TGF-β1作為DPN的標志物。這與本研究的結果未折疊的蛋白反應和生長因子可能與DPN相關的觀點一致。

此外，本研究還暗示了P53、細胞頂端連接和UV誘導反應與DPN有關的可能性，這些可能涉及的分子機制不同于DM的分子機制，有助于未來發掘更多的DPN獨立于DM的機制成因。

綜上，本研究利用生信分析，探討了DPN的成因，從側面補充了動物實驗的論點，為DPN的研究提供一些參考，但這些機制還需要進一步的分子實驗進行證明。

參考文獻

[1] Kautzky W，et al.Sex and gender differences in risk，pathophysiology and complications of type 2 diabetes mellitus.Endocr Rev，2016.

[2] Cameron E，et al.Vascular factors and metabolic interactions in pathogenesis of diabetic neuropathy.Diabetologia，2001

[3] Bommer，C，et al，Global Economic Burden of Diabetes in Adults.Diabetes Care，2018.

[4] Duckworth W，et al.Glucose control and vascular complications in veterans with type 2 diabetes.N Engl J Med.2009.

[5] 劉紅梅，等.血糖波動對糖尿病大鼠周圍神經病變影響的研究.中國糖尿病雜志，2019.

[6] 程思宇，等.基于NFκb信號通路探究當歸四逆湯對糖尿病大鼠周圍神經病變保護機制.長春中醫藥大學學報，2019.

[7] 周夏慧，等.當歸多糖對DPN大鼠TLR4/MyD88/NFκB通路抑制影響.中國臨床藥理學與治療學，2013.

[8] 呂翠巖.中藥復方糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經TNF-α-NF-κB途徑的影響.中華中醫藥雜志，2016.

[9] Rojas R，et al.Hypoxia-inducible factor 1α protects peripheral sensory neurons from DPN by suppressing accumulation of reactive oxygen species.J Mol Med，2018.

[10] O'Brien D，et al.ER stress in diabetic peripheral neuropathy：a new therapeutic target. Antioxidants redox signal，2014.

[11] Ybarra J，et al.Transforming growth factor beta1 as biomarker of DPN.J Diabetes Complications，2010.