解淀粉芽孢桿菌鑒定、育種及其抗細(xì)菌活性研究進(jìn)展

潘林1，王卿惠，王世偉1，李波1，朱研文1，盧思帆1，周子強(qiáng)1

解淀粉芽孢桿菌鑒定、育種及其抗細(xì)菌活性研究進(jìn)展

潘林1，2，王卿惠3，王世偉1，2，李波1，2，朱研文1，2，盧思帆1，2，周子強(qiáng)1，2

（齊齊哈爾大學(xué) 1. 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

解淀粉芽孢桿菌可作為微生物殺菌劑，能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，殺菌譜廣；對(duì)病原菌具有防治作用，可防治作物、蔬菜、瓜果病害，使用該殺菌劑有助于減少化學(xué)農(nóng)藥，保證食品安全．對(duì)解淀粉芽孢桿菌的分離、鑒定及其抗細(xì)菌活性的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為解淀粉芽孢桿菌抗細(xì)菌活性物質(zhì)的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)．

解淀粉芽孢桿菌；鑒定；育種；抗細(xì)菌活性

解淀粉芽孢桿菌（）具有廣泛抗菌能力，在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、果蔬采后病害防治、環(huán)保方面具有廣泛的應(yīng)用前景[1]．作為一種良好的益生菌，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原真菌和細(xì)菌的防治；作為生物農(nóng)藥，具有日趨取代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的趨勢(shì)[2-3]．解淀粉芽孢桿菌自身的生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括抗菌蛋白、脂肽類和聚酮化合物等．其中抗菌脂肽在植物病害防控上發(fā)揮重要作用，具有綠色、安全、高效等優(yōu)勢(shì)[4]．抗菌蛋白是一類對(duì)植物病原菌具有強(qiáng)烈抑制作用的活性蛋白，由于其抑菌機(jī)制特殊，不易產(chǎn)生抗性，對(duì)人體與環(huán)境不會(huì)造成危害[5-6]．盡管目前解淀粉芽孢桿菌分類、鑒定、抗菌物質(zhì)、抗菌機(jī)理以及與植物互作的研究已經(jīng)逐漸深入，但是解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定、抗細(xì)菌，特別是致病性細(xì)菌的研究還比較少，因此深入研究其抗細(xì)菌的種類和機(jī)制對(duì)解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用具有重要意義．解淀粉芽孢桿菌的新菌株分離、鑒定及抗細(xì)菌作用的機(jī)理研究將使其更廣泛、大規(guī)模地應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生及食品加工業(yè)等重要領(lǐng)域．

1　解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定與育種

1.1　解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌（）親緣性很高的細(xì)菌，分布極其廣泛，具有多樣性功能．

解淀粉芽孢桿菌可以分離于各種土壤（包括菜園土壤）、動(dòng)植物體內(nèi)、海水等環(huán)境．多采用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩，雙層平板法進(jìn)行復(fù)篩（如B11），通過(guò)抑菌帶判斷其抗菌活性，通過(guò)菌株生理生化特征和其分子生物學(xué)手段對(duì)其加以鑒定（見表1）．如K6菌株分離于菜園土壤，具廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌均具抑制作用．但K6菌株對(duì)G+菌抑制作用最強(qiáng)，對(duì)霉菌抑制相對(duì)較弱，該菌對(duì)不同微生物具有不同抑制作用．FKB-1菌株分離于阜康市食用菌栽培基，對(duì)綠色木霉菌（）抑制效果穩(wěn)定，是一株優(yōu)良抗木霉菌生防菌．從鯽魚腸道中分離的JX001菌株對(duì)嗜水氣單胞菌（）抑制作用較強(qiáng)，能防止養(yǎng)殖水中嗜水氣單胞菌暴發(fā)，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展．并能產(chǎn)生大量蛋白酶，可用于蛋白質(zhì)飼料降解．分離于連云港海域海水的GM-1菌株經(jīng)自發(fā)突變獲得GM-1-2，能明顯抑制白色念珠菌（）生長(zhǎng)．可見，分離到優(yōu)良的菌株是進(jìn)一步研究解淀粉芽孢桿菌的關(guān)鍵，為下一步進(jìn)行培養(yǎng)、條件優(yōu)化和其它功能研究奠定了基礎(chǔ)．

表1　解淀粉芽孢桿菌的分離和鑒定

1.2　解淀粉芽孢桿菌的育種

育種是獲得優(yōu)良菌株的重要手段．在解淀粉芽孢桿菌的育種工作中，可以采用自發(fā)突變和人工誘變，通過(guò)選育不僅能提高解淀粉芽孢桿菌的生防效果，也可提高生物轉(zhuǎn)化能力．汪晶晶[12]等為了闡明GM-l自發(fā)突變菌株變異與抗菌活性的關(guān)系，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA和gyrB基因序列對(duì)自發(fā)突變（GM-1-2）進(jìn)行了分析．使用8種植物病菌為供試菌，采用平板對(duì)峙和牛津杯法檢驗(yàn)GM-1-2菌株及其發(fā)酵液抑菌作用；采用硫酸銨沉淀法初步分析了其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GM-l-2與GM-1菌落形態(tài)、顏色、菌體大小不但無(wú)明顯差異，而且生理生化特性、16S rDNA和gyrB序列也相同．但GM-1-2菌種對(duì)小麥根腐病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、大豆菌核病菌、小麥雪腐病菌、甘藍(lán)枯萎病菌、斑點(diǎn)落葉病菌、黃瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制明顯高于原始出發(fā)菌株GM-1．抑菌帶寬度提高了0.2~9.0 mm，無(wú)菌發(fā)酵液抑制率提高了1.1%~153.7%．抑菌物質(zhì)存在于硫酸銨沉淀中．可見，抑菌作用與菌體形態(tài)、16S rDNA和gyrB序列并無(wú)確切的相關(guān)性，推測(cè)可能是自發(fā)突變使其基因組其它基因發(fā)生變異而使抗性基因受到影響，或抗性基因發(fā)生突變，而使抗性特性得以提高的結(jié)果，具體的抑菌機(jī)制尚有待闡明．

誘變育種在菌種選育中具有重要意義．解淀粉芽孢桿菌的誘變可以增加次生代謝產(chǎn)物的含量，提高抗菌活力．解淀粉芽孢桿菌BI2能產(chǎn)生N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG），選用等離子體和紫外雙重復(fù)合誘變，篩選到的BH-3-2菌株較出發(fā)菌株NAG產(chǎn)量提高4倍．3-羥基丁酮作為一種重要的食用香料和平臺(tái)化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域．采用常壓室溫等離子體（ARTP）和60Co射線復(fù)合誘變，獲得高產(chǎn)3-羥基丁酮突變株H-5（68.2 g/L）．5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)優(yōu)化后于30 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，最終3-羥基丁酮產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高26.8%．胡蘿卜軟腐歐文氏菌（sub sp. carotovora，Ecc）能引起細(xì)菌性軟腐病，是采后蔬菜腐敗的因素，BGP20對(duì)該病害具有較好的生防效果．在200~800 Gy劑量范圍內(nèi)，60Co對(duì)BGP20的致死率隨著輻照劑量增加而上升；600 Gy劑量60Co輻照致死率為78.3％．選用該劑量進(jìn)行誘變選育，利用辣椒（L.）對(duì)409株突變菌株進(jìn)行生防效果活體評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)突變菌株BGP20-1生防效果顯著提高（見表２）．可見，復(fù)合誘變?cè)谟N工作中起到了重要作用，在育種中應(yīng)該發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)．

表2　解淀粉芽孢桿菌的誘變

2　解淀粉芽孢桿菌抗細(xì)菌作用研究

解淀粉芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，具有廣泛抗菌能力．在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、果蔬采后病害防治、環(huán)保和食品安全等領(lǐng)域已具有廣泛應(yīng)用前景．目前解淀粉芽孢桿菌分類、鑒定、抗菌物質(zhì)、抗菌機(jī)理以及與誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)病原菌的系統(tǒng)性研究已經(jīng)逐漸深入，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性．研究發(fā)現(xiàn)其不但能對(duì)一些桿菌、球菌具有抗性，而且對(duì)單胞菌、藍(lán)細(xì)菌等多種細(xì)菌具有抗性，因此具有極好的應(yīng)用價(jià)值．同時(shí)，某些同一菌株能對(duì)多種細(xì)菌產(chǎn)生抗性，即有多效抗細(xì)菌活性．深入研究其產(chǎn)生的抗細(xì)菌化合物以及抗細(xì)菌機(jī)制具有重要意義．

2.1　解淀粉芽孢桿菌抗桿菌活性研究

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對(duì)桿菌具有較強(qiáng)抗性．Song[16]等發(fā)現(xiàn)淀粉芽孢桿菌anti-CA產(chǎn)生的脂肽6-2能破壞生物膜形成細(xì)菌（綠濃桿菌PAO1）完整細(xì)胞和原生質(zhì)體，對(duì)蠟樣芽孢桿菌（）也有抗性．在綠膿桿菌（）PAO1內(nèi)與胞外多糖相關(guān)的PslC基因表達(dá)明顯受到抑制．Chi[17]等發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌R3產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)能抗大腸桿菌（）．這些活性物質(zhì)本質(zhì)上是生物表面活性素（F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5），具有氨基酸（GLLVDLL）和羥基脂肪酸（碳長(zhǎng)度為12~15），具有廣譜抗細(xì)菌活性，對(duì)多藥物抗性病原大腸桿菌具有抗性．經(jīng)F1處理后，2#全細(xì)胞和原生質(zhì)體細(xì)胞膜均受到損傷，整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞破粹．可見，解淀粉芽孢桿菌對(duì)細(xì)菌的抗菌物質(zhì)，包括脂肽類化合物和表面活性劑，能抑制桿菌相關(guān)基因表達(dá)或破壞桿菌細(xì)胞膜，殺死桿菌細(xì)胞．

2.2　解淀粉芽孢桿菌抗球菌活性研究

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對(duì)不同的球菌也具有抗性．Jeyanthi[18]等發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌MHB1生物活性物質(zhì)對(duì)抗甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌（）（MRSA）具有抗性．其活性成分具有酚特性，分子量為507Da，能改變MRSA細(xì)菌內(nèi)超微結(jié)構(gòu)而抑制其生長(zhǎng)．Gowrishankar[19]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌MMS-50產(chǎn)生的活性成分（AF）主要為Cyclo（L-leucyl-L-prolyl）．該活性物質(zhì)能減弱鏈球菌黏附力、產(chǎn)酸和耐酸能力、葡聚糖合成能力、生物膜形成能力和細(xì)胞表面疏水性，從而抑制鏈球菌引起的齲齒危害；MMS-50 AF也具有抗生物膜和抗毒活性，能明顯減少毒力基因的表達(dá)．解淀粉芽孢桿菌AP183有機(jī)活性物質(zhì)為一種新型大環(huán)多烯類抗生素bacillusin A（1）．Ravu[20]等通過(guò)核磁共振和質(zhì)譜分析，確定該物質(zhì)是一種新型大環(huán)內(nèi)二酯，對(duì)抗甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌和抗萬(wàn)古霉素屎腸球菌（）均具有抗性．Arguelles Arias[21]等對(duì)解淀粉芽孢桿菌GA1部分基因組進(jìn)行了測(cè)序，鑒定了專門用于新羊毛硫細(xì)菌素amylolysin合成的基因簇aml．純化的amylolysin對(duì)抗新青霉素的金黃色葡萄球菌具有明顯抗性．Regmi[22]等從發(fā)酵食品（kimchi）分離出與解淀粉芽孢桿菌FZB42（T）同源性達(dá)99.79%的菌株．該菌產(chǎn)生的抗微生物肽（CSpK14）與-內(nèi)酰胺類藥物配合能有效抑制抗萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）和腸球菌（VRE）．CSpK14摩爾質(zhì)量為4.6 kDa，其N-端氨基酸序列為H-Y-D-P-G-D-D-S-G-N-T-G，與已報(bào)導(dǎo)的多肽幾乎無(wú)同源性．但與來(lái)自不同微生物的alpha-2-巨球蛋白和配體門控通道蛋白具有某種程度的一致性．可見，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的抗球菌活性物質(zhì)具有明顯的多樣性，不但對(duì)耐藥性球菌具有明顯抗性，而且能與其它已有藥物組合增強(qiáng)其藥物療效，是新藥開發(fā)重要資源．

2.3　解淀粉芽孢桿菌抗黃單胞菌和藍(lán)細(xì)菌活性研究

細(xì)菌凋萎病和細(xì)菌葉斑病由水稻黃單胞菌（pv. oryzae，Xoo）、稻旁葉螨和禾薭引起．Wu[23]等使用熒光、掃描電鏡、投射電鏡揭示解淀粉芽孢桿菌FZB42產(chǎn)生的地非西丁和桿菌溶素能引起黃單胞菌（簡(jiǎn)稱Xoo）細(xì)胞壁和細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使單胞菌毒力、細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁合成等基因表達(dá)明顯下調(diào)，從而抑制水稻凋萎病和細(xì)菌葉斑病發(fā)生．在水稻的抗病方面具有應(yīng)用潛力．赤潮由大規(guī)模的獨(dú)特藻類和藍(lán)細(xì)菌（）引起，屬世界性嚴(yán)重環(huán)境問題．Wu[24]等還發(fā)現(xiàn)菌株FZB42可用于防治藍(lán)藻（藍(lán)細(xì)菌），對(duì)銅綠微囊藻（）、淡水藻類殺滅率達(dá)98.78%．抗藍(lán)細(xì)菌物質(zhì)的合成不依于脂肽和聚酮非核糖體合成時(shí)所必需的Sfp酶，但與桿菌溶素sfp-i非依賴型合成所用的基因簇有關(guān)．桿菌溶素（Bacilysin）能引起海藻細(xì)胞壁和細(xì)胞器膜顯著變化，導(dǎo)致細(xì)胞溶解．FZB42產(chǎn)生桿菌溶素可作為藍(lán)細(xì)菌防控藥劑，減輕水華引起的環(huán)保環(huán)境危害．

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的部分抗細(xì)菌活性物質(zhì)及其抗菌機(jī)理見表3．由表3可見，解淀粉芽孢桿菌抗細(xì)菌活性物多種多樣，其所抗細(xì)菌也具有多樣性，包括桿菌、球菌和藍(lán)細(xì)菌等．其抗菌機(jī)理也是多方面的，包括破壞不同層次細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞的功能特性以及抑制相關(guān)基因的表達(dá)．研究解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的活性物及其抗菌機(jī)理具有重要意義．

表3　解淀粉芽孢桿菌活性物質(zhì)與抗細(xì)菌機(jī)理

2.4　解淀粉芽孢桿菌多效抗細(xì)菌活性研究

Xu[25]等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌M1產(chǎn)生的脂肽對(duì)多種抗藥性弧菌（Vibrio）及希瓦氏菌（）具有抗性．其產(chǎn)生的脂肽N3是主要活性物質(zhì)，包含表面活性劑同系物，帶有氨基酸（GLLVDLL）和羥基脂肪酸（碳鏈長(zhǎng)度12~15）．研究發(fā)現(xiàn)，脂肽N3對(duì)海水希瓦氏菌和9種弧菌均具有抗性，M1產(chǎn)生脂肽有廣譜抗菌作用，對(duì)多藥物抗性植物病原性弧菌有較強(qiáng)抗性．用脂肽N3處理后，海水希瓦氏菌細(xì)胞膜受損，整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞破裂死亡．硫醚抗生素是熱穩(wěn)定性多肽，存在硫醚氨基酸、羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸，能抑制單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌（）、金黃色葡萄球菌（）、蠟狀芽孢桿菌（）等多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌生長(zhǎng)．Arguelles Arias[26]等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌GA1能產(chǎn)生一種抗微生物肽amylolysin，能抗甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌．根據(jù)GA1基因組特征推測(cè)，其含有羊毛硫細(xì)菌素基因簇（結(jié)構(gòu)基因（A）、修飾基因（M）、運(yùn)輸基因（T）、調(diào)節(jié)基因（KR）和免疫基因（FE））．A基因破壞導(dǎo)致amylolysin活性損失，說(shuō)明該基因簇與amylolysin合成有關(guān)．基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行和液質(zhì)聯(lián)用分析說(shuō)明amylolysin是一種迄今沒有描述過(guò)的新羊毛硫細(xì)菌素，肽屬于羊毛硫細(xì)菌素B族．可見，合理利用解淀粉芽孢桿菌的多功能抗細(xì)菌活性，不僅能為其作用機(jī)理的研究提供數(shù)據(jù)，而且也能為尋找新的多功能抗細(xì)菌類藥物開辟新渠道．

解淀粉芽孢桿菌廣泛存在于自然界．它不但對(duì)多種微生物包括真菌、細(xì)菌及病毒產(chǎn)生抑制作用，而且能產(chǎn)生重要的代謝酶類．在動(dòng)植物病害防治、促生、定殖、益生等多方面具有廣闊的應(yīng)用前景．但一直以來(lái)關(guān)于解淀粉芽孢桿菌對(duì)細(xì)菌的抗性研究要比對(duì)抗真菌的研究相對(duì)較少．隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)在該領(lǐng)域的應(yīng)用，解淀粉芽孢桿菌抗細(xì)菌作用機(jī)制的研究，抗細(xì)菌活性物質(zhì)以及其合成基因和調(diào)節(jié)基因功能的研究必將逐漸深入．解淀粉芽孢桿菌抗細(xì)菌機(jī)理的闡明，將使解淀粉芽孢桿菌在動(dòng)植物病蟲害的防治、生物轉(zhuǎn)化、生物肥的研制和開發(fā)領(lǐng)域得到更好的應(yīng)用．

3　展望

解淀粉芽孢桿菌是不同于枯草芽孢桿菌的芽孢桿菌屬中的具有重要研究和應(yīng)用價(jià)值的一個(gè)安全菌種．隨著分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有越來(lái)越多的菌株得以鑒定和應(yīng)用．分子標(biāo)記技術(shù)（如16 S DNA基因標(biāo)記）能快速鑒定它與枯草芽孢桿菌的區(qū)別，但為了更準(zhǔn)確鑒定該菌，采用全基因組測(cè)序技術(shù)是非常快速有效的方法．對(duì)該菌準(zhǔn)確地鑒定是研究其抗細(xì)菌活性物與抗細(xì)菌機(jī)理的基礎(chǔ)．隨著該菌抗細(xì)菌活性物的多樣性以及抗細(xì)菌機(jī)理的深入研究，該菌在植物細(xì)菌病的防治、醫(yī)療保健以及環(huán)境保護(hù)方面的安全應(yīng)用必將更加廣泛，將創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益．

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Research progress of the identifiation，breeding and antibacterial effects of

PAN Lin1，2，WANG Qinghui3，WANG Shiwei1，2，LI Bo1，2，ZHU Yanwen1，2，LU Sifan1，2，ZHOU Ziqiang1，2

（1. School of Life Science and Agriculture Forestry，2. Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Preservation of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；3. School of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

can be regarded as a microbiological bactericidal agent，which can produce a variety of antibacterial active substances and has a wide sterilization spectrum．It can prevent and cure diseases of crops，vegetables，fruits and melons．The use of this fungicide can help reduce chemical pesticides and ensure food safety．The isolation，identification and its antibacterial effects were reviewed，which lay a foundation for the development and utilization of anti-bacterial active substances．

；identification；breeding；antibacterial effects

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2020.06.013

1007-9831（2020）06-0059-06

2020-02-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31670375）；2018年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（201810232177）；2018年度黑龍江省教育廳基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（自然科學(xué)類面上項(xiàng)目，135309482）

潘林（1964-），男，黑龍江齊齊哈爾人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事動(dòng)物學(xué)研究．E-mail：plin@163.com

王世偉（1965-），男，山東肥城人，教授，博士，從事微生物遺傳與發(fā)酵工程研究．E-mail：wsw888535@shou.com