基于相對遷移率的節節麥醇溶蛋白組成分析

葉發慧 ，察艷艷，馮美玲，李 響，, ，劉瑞娟，，曹 東， ，張 波， ，劉寶龍，，陳文杰，，張懷剛

(1.中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，中國科學院 西北高原生物研究所，中國科學院 種子創新研究院，西寧 810008；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810008；4.青海大學，西寧 810016；5.青海師范大學，西寧 810008)

普通小麥(TriticumaestivumL,AABBDD,2n=6x=42)是世界廣布的重要糧食作物，為人類提供30%糧食[1]，小麥面粉品質與人類的營養狀況直接相關。小麥面粉品質由小麥胚乳中的貯藏蛋白決定。麥醇溶蛋白(Gliadin，Gli)是小麥儲藏蛋白的主要成分之一，在胚乳蛋白中高達40%，可通過二硫鍵與麥谷蛋白結合成穩定的網狀結構，從而賦予面筋一定的可塑性、粘性和延展性[2]。麥醇溶蛋白由小麥第1、第6部分同源群染色體短臂上的Gli-1和Gli-2位點編碼[3]。Gli-1位點包括Gli-A1、Gli-B1和Gli-D1；Gli-2位點包括Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2[4]。麥醇溶蛋白的位點都表現出廣泛的等位基因變異，到目前為止，在普通小麥的Gli-1和Gli-2位點上已鑒定出多于130個等位變異[5]。根據醇溶蛋白在酸性(pH3.1)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acidic polyacrylamide gel electrophoresis，A-PAGE)中遷移率的不同，進一步將醇溶蛋白細分為α，β，γ和ω醇溶蛋白(遷移率大小為ω<γ<β<α)[6]。麥醇溶蛋白譜帶組成幾乎不受環境影響，完全由基因控制[7]。因此，它也可作為特殊的生化和分子標記，用于揭示不同材料間的遺傳差異[8]。少數骨干親本雜交等傳統小麥育種手段，導致現代小麥品種的遺傳背景日趨狹窄，嚴重限制了小麥面粉品質的進一步提高。從具有更廣泛遺傳變異的普通小麥野生近緣物種中，發掘具有優質基因的種質資源并加以利用，是普通小麥遺傳改良的有效途徑[9]。

節節麥(Aegilopstauschii,DD,2n=2x=14)是普通小麥D染色體組的二倍體供體物種[10]，廣泛分布于西起中東各國，東至中國的廣闊地域，具有豐富的遺傳多樣性[11]，擁有大量現代普通小麥品種所不具備的有益基因[12-14]。節節麥中醇溶蛋白位點的結構和作用機制與普通小麥相似[15-16]，Gli-D1和Gli-D2位點具有多個等位基因的特征，這使得區分系、遺傳、變種和亞種，研究種群結構和確定它們的系統發育關系成為可能[17]。節節麥D染色體組與普通小麥D染色體組完全同源，其優良基因可通過遠緣雜交直接轉移到普通小麥中, 培育新的普通小麥品種[18-20]。

本研究通過對212份節節麥材料的醇溶蛋白進行酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)檢測，分析其遺傳多樣性，旨在了解這些節節麥種質資源的醇溶蛋白多樣性狀況，為后續遠緣雜交親本的選擇和進一步的小麥品種改良提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年春季在中國科學院西北高原生物研究所青海省作物分子育種重點實驗室 進行。

供試材料為筆者前期已收集的212份節節麥種質資源(表1、表2)，其中15份來自中國，58份地理位置不詳。

普通小麥‘中國春’作為對照材料，用以確定212份節節麥的醇溶蛋白組成類型。

表1 供試材料來源地Table 1 Origin of test materials

1.2 方 法

1.2.1 醇溶蛋白的提取 醇溶蛋白的提取參照傅賓孝等[21]的方法并稍做改動。(研磨籽粒的量由1 粒改為半粒，蛋白提取液由100 μL改為 50 μL)。

1.2.2 溶液配制 溶液的配制參照王祖華等[22]的方法。

1.2.3 電泳分離 用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離醇溶蛋白(A-PAGE)。將兩塊玻璃板清洗干凈后用體積分數為70%的酒精再次清洗，涂上含量為2% 的剝離硅烷。將裝好的玻璃板傾斜放置在泡沫板上，取5～10 mL凝膠液按體積比1∶1比例加入體積分數為1.2%的過氧化氫，迅速搖勻，沿長玻璃板內表面倒入底部，10 min后封底。玻璃板底部和泡沫板之間放 2 個10 μL規格的槍頭，便于底部凝膠倒吸。取30 mL凝膠原液，加入體積比1∶1的體積分數為1%的過氧化氫，迅速搖勻，沿長玻璃板內表面倒入玻璃板夾縫中，直至溢出,迅速插入樣品梳，靜止3 h，慢慢垂直拔出樣品梳。每個樣品槽內加入樣品8 μL，兩端加入‘中國春’作對照。反向連接電路，設置額定電壓350 V，電流30 mA，時間2 h。

1.2.4 染色 電泳結束后取下玻璃板，留下黏附凝膠的玻璃板，將凝膠和玻璃板一起放入考馬斯亮藍染色液中，染色1 h。將膠和玻璃板一同取出，清水沖去表面染料，無需脫色，連同玻璃板一起拍照保存。

1.2.5 命名 參照Autran等[23]的命名方法，以‘中國春’的電泳圖譜為標準，‘中國春’的第1條譜帶(遷移率最小的條帶)作為標準帶，其他譜帶的遷移率與它的遷移率比值作為相對遷移率來確定各蛋白質條帶的位置,‘中國春’第1條譜帶的相對遷移率記為1。

1.3 數據處理

利用Gis軟件獲得遷移率；按Bushuk 等[24]的計算系統，以‘中國春’為對照，計算節節麥醇溶蛋白的相對遷移率。根據相對遷移率大小將電泳譜帶分為α、β、γ 和 ω 4 個區。按照條帶的有無將結果計為 1(有)和 0(無)， 利用NTsys軟件計算品種間相似系數(GS)，用 GS值按不加權成對群算術平均法(U-PGMA)進行聚類分析。統計分析在 Microsoft Excel 2013中進行。

2 結果與分析

2.1 醇溶蛋白條帶多態性分析

212份材料共分離出2 143 條譜帶(部分材料電泳圖見圖1)，單個材料變幅為7～16條，平均為10.11條，大部分有9～12條，占總條帶的 73.11%(表2)；18份材料(8.49%)分離出12條以上的譜帶，39份材料(18.40%)分離出9條以下的譜帶。來自巴基斯坦的388號分離出的譜帶最多，為16條；其次是來自阿塞拜疆的346號材料，分離出15條譜帶；19份材料(8.96%)均分離出7條譜帶，主要來自阿塞拜疆和烏茲別克斯坦。來自中國的15份材料分離出13、12、11、10、9、8條譜帶，分別占6.67%、20.0%、13.3%、 13.3%、20.0%和 26.67%。212份材料共分離出422種不同相對遷移率的譜帶(表3)，譜帶相對遷移率的變幅為0.27～5.82；第一條譜帶相對遷移率最小的是37號材料，這份材料兩條譜帶的相對遷移率為0.72和0.89,均小于1；最后一條譜帶的相對遷移率為5.82，是44號材料和321號材料，其中44號材料分離出的最小譜帶的相對遷移率為0.99。譜帶頻率變幅為0.24%～ 7.35%，44號材料相對遷移率出現次數最多，為 7.35%，其次是58號；有94種相對遷移率只出現1 次。對照‘中國春’共分離出17條譜帶，遷移率為1～5.15，在所有材料中，有28份材料譜帶的相對遷移率小于1，其中6份材料的2條帶均小于1；譜帶相對遷移率大于 5.15的材料共有60份，18號、19號、24號、34號、41號、43號和44號7份材料均分離出12～13條譜帶，第一條譜帶的相對遷移率小于1，最后一條譜帶的相對遷移率大于5.15。

表2 供試材料編號及其醇溶蛋白帶數Table 2 Number of test materials and the number of gliadin bands

(續表2 Continued table 2)

箭頭代表相對遷移率為1的主帶

參照Bushuk 等[24]的方法，根據相對遷移率大小將422種譜帶分為 α、β、γ 和 ω 4 個區(表4)。α區有362條譜帶，占總數的16.89%，127種變異類型，占總數的30.09%；β區有470條譜帶，占總數的21.93%,有60種變異類型，占總數的14.22%；γ區有483條譜帶，占總數的 22.54%，有105種變異類型，占總數的24.88%；ω區有828條譜帶，占總數的30.81%，有130種變異類型，占總數的30.81%。ω區譜帶數最多，占總譜帶數的38.64%，α區多態性條帶最多，高達34.70%，譜帶組合類型最多。

2.2 遺傳相似系數分析

利用NTsys軟件對212份材料進行遺傳相似性分析，發現這些材料的遺傳相似系數(GS)變幅為0～0.58，平均值為0.037。不存在GS值為1的現象，而有68.54%的GS值為0。來自中國的18號和19號材料的GS值最高(0.58)，表明二者親緣關系最近。

2.3 U-PGMA聚類分析

對212份材料進行基于UPGMA法的聚類分析(圖2)，212份材料在GS=0.032水平上可分為5個大類。第Ⅰ類包含8份材料，部分材料來自伊朗(3份)和烏茲別克斯坦(1份)，可分為2個亞類，各包含4份材料；這一類群的遺傳相似系數最小，分布面積較局限，并沒有大面積出現。第Ⅱ類包含35份材料；部分材料來自伊朗(7份)、中國(7份)、塔吉克斯坦(4份)、土耳其(2份)、巴基斯坦(1份)、格魯尼亞(1份)、阿塞拜疆(2份)和法國(2份)，可分為2個亞類，分別包含6份和29份材料。這一類群中包含7份伊朗材料和7份中國材料，兩者遺傳相似系數高；中國的材料1份來自新疆(11號)，3份來自河南(18號、19號和20號)，3份來源地不詳(10號、22號和23號)。第Ⅲ類包含23份材料，部分來自伊朗(6份)、中國(1份)、土庫曼尼斯坦(1份)、烏茲別克斯坦(3份)、阿富汗(1份)、土耳其(1份)、巴基斯坦(3份)、塔吉克斯坦(1份)和阿塞拜疆(1份)，可分為2個亞類，分別包含9份和14份材料。第Ⅳ類包含8份材料，部分來自伊朗(1份)和巴基斯坦(2份)，可分為2個亞類，分別包含3份和5份材料。第Ⅴ類包含139份材料，部分來自伊朗(11份)、巴基斯坦(18份)、阿富汗(9份)、土耳其(15份)、烏茲別克斯坦(8份)、阿塞拜疆(8份)、中國(7份)、阿拉伯(2份)、哈薩克斯坦(2份)、吉爾吉斯斯坦(1份)、俄羅斯(4份)、塔吉克斯坦(4份)、土庫曼尼斯坦(1份)、亞美尼亞(1份)和印度(1份)，可分為3個亞類，分別包含43、58和37份材料；7份來自中國，1份新疆(12號)，2份陜西(14號和248號)，2份河南(16號和265號)，2份產地不詳(24號和29號)；中國的材料與巴基斯坦、阿富汗的材料親緣關系較近。筆者據此推測，伊朗地區至少存在5類節節麥居群，并具有5種可能的對外傳播擴散路徑(圖3)。

表3 不同遷移率在212份材料中出現的頻率Table 3 Frequency of different mobilities in 212 materials

(續表3 Continued table 3)

表4 4個區醇溶蛋白帶型統計結果及多樣性Table 4 Statistical results of gliadin in four zones and diversity of gliadin

3 討 論

1959年Jones第一次將醇溶蛋白劃分為α、β、γ 和 ω 4個區[7]，1975年Gubareva利用加拿大栽培小麥的電泳圖對其進行命名，稱為“數字字母命名”系統[24]。其公式表示方法為：按遷移率的大小，將α、β、γ和ω 4 個區域分別分成 1～7、1～5、1～5 和 1～12 條譜帶；染色強烈的譜帶的數字添加下劃線表示，染色弱的數字添加圓括號表示，而雙重線則用數字上方的兩個點表示。下標1表示2區移動快的臨近波，下標2表示移動慢的臨近波。同年，Autran等[25]利用生長在法國的春小麥和冬小麥的電泳圖再次對4區進行規范，根據遷移率為65的γ-醇溶蛋白計算其余譜帶的相對遷移率，并將相對遷移率為0.65的譜帶定位主帶。在后面研究中發現，法國命名系統并不能應用到加拿大栽培小麥上，1977年Bushuk等[24]發現這一問題，并將法國材料的主帶定為相對遷移率為0.5的譜帶。因為試驗材料的地域等差異，本研究中的材料未找到其遷移率為0.5的主帶，由此可見，麥醇溶蛋白現有的命名方法并不具備廣泛的普適性。筆者經過多次重復試驗證明，在保證時間、電壓、電流等試驗參數一致的前提下，‘中國春’的第1條譜帶清晰易辨識，相對位置也比較穩定，可作為對照標準帶。將其他譜帶的遷移率和‘中國春’第1條譜帶遷移率的比值作為相對遷移率來確定各醇溶蛋白條帶的位置，可準確鑒定每一條醇溶蛋白譜帶，且無需除‘中國春’以外的其他材料作為對照。

圖2 212份種質材料醇溶蛋白聚類圖Fig.2 Clusters of 212 accessions based on gliadin band patterns

圖3 節節麥可能的傳播路徑Fig.3 Material propagation path

本研究從212份節節麥材料中共發現422種不同遷移率的譜帶，譜帶出現頻率變幅為0.24%～ 7.35%。譜帶相對遷移率變幅為0.27～5.82。根據相對遷移率的大小，可將譜帶分為 α、β、γ 和 ω 4 個區，其中處于α區譜帶的相對分子質量最小，相對遷移率最大，可能由于擴散效應等原因，在A-PAGE膠圖上最不清晰。為提高該區譜帶的辨識度，建議使用雙向電泳等其他方法驗證α區譜帶組成。本研究中，譜帶遷移范圍最大的是44號材料，范圍最小的是阿富汗的270號材料。小于對照‘中國春’第1條主帶和大于對照‘中國春’最后一條譜帶的材料分別有28份和60份。有7份材料譜帶的最小相對遷移率小于1，最大相對遷移率大于5.15(譜帶遷移范圍大于對照‘中國春’)。這7份材料在聚類圖(圖2)中分布在Ⅱ類(4份)、Ⅲ類(1份)和Ⅴ類(2份)，在第Ⅱ類的4份中，18號材料和19號材料來自中國，34號材料地理位置不詳，但它和來自中國的材料親緣關系最近；同樣，位于第Ⅲ類群的44號材料也是材料地理位置不詳，但它和來自中國的材料近緣關系最近。位于第Ⅴ類群中的24號材料也來自中國。由此可見，中國的節節麥居群中存在著具有較廣遷移率范圍醇溶蛋白譜帶的材料。醇溶蛋白譜帶遷移范圍異常的材料是否會對小麥品質改良有積極作用呢？值得進一步研究。

結合參試材料的聚類結果(圖2)和地理分布(圖3)，發現來自伊朗的材料遺傳多樣性最豐富，此結果支持節節麥的起源地是伊朗地區的觀點[26]。中國境內的節節麥至少存在 3 種類型。一類(類型Ⅴ)遍布節節麥的自然分布區，而另兩類(類型Ⅱ和Ⅲ)則是在西北南三個方向上僅存在于伊朗及其毗鄰地區，唯獨向東一路分布到中國。這兩類材料是以伊朗→土庫曼尼斯坦→塔吉克斯坦→中國的單線路徑傳播，并沒有向四周擴散，而這一路徑正好與古絲綢之路陸路中的一條不謀而合，由此可見，至少不能排除這類材料是經古絲綢之路等人為途徑傳播至中國的可能。從聚類結果來看，類型Ⅱ中，和伊朗原始材料親緣關系最近的11號材料來自中國新疆，18、19和20號材料來自中國河南。來自新疆的12號材料、陜西的14號、248號材料和河南的265號材料同處于第Ⅴ類群中，親緣關系較近，根據這些結果可以推測，中東地區節節麥從阿富汗和巴基斯坦傳入中國新疆地區后(主要是巴基斯坦)，很可能繼續向東傳播到黃河中下游地區。這與筆者之前新疆及黃河流域節節麥的高分子谷蛋白研究結果一致(未發表資料)。