冰川棘豆(Oxytropis glacialis)根系土壤細菌多樣性特征

曹鵬熙,劉怡萱,許國琪,姬亞麗,李敬科,李小燕,劉 星,,*

1 西藏大學理學院,拉薩 850000

2 武漢大學生命科學學院,武漢 430072

青藏高原地處地球“第三極”,具有高寒、低氧、強輻射及晝夜溫差大等特點,使其生態類型獨特,富含特殊的生物資源[1,2],植物和土壤微生物長期在這種極端環境的脅迫下,構建了一套復雜而穩定的互作系統,反映了植物和微生物的適應策略[3]。最新研究發現,青藏高原整體變暖的趨勢會使土壤微生物活動增加,并引起植物緯度轉移,導致整個高原面的陸地生態系統發生顯著性變化[4],同時,青藏高原土壤微生物、植物和動物多樣性與高寒生態系統的功能呈正相關,土壤細菌和植物多樣性共同對生態系統多功能性變異的解釋度為45%[5]。青藏高原作為全球生物多樣性研究的熱點地區之一,有關植物根部的微生物群落多樣性特征,及微生物群落如何受到土壤理化因子的調節受到關注較少,尤其針對高寒草原有毒有害植物。

冰川棘豆是棘豆屬(OxytropisDC)植物,為青藏高原特有種和廣布種[6],多年叢生草本,莖極縮短,生長于海拔4500-5400m的礫石山坡、山坡草地、河灘礫石地和砂質地,主要分布于西藏阿里和那曲等地[7]。冰川棘豆全株有毒,屬于瘋草的一種,內含一種名為苦馬豆素(Swainonine,Sw,1,2,8-trihydroxyoctahydro indolizidine)的毒性生物堿,干枯后仍然保留毒性作用,動物攝食后會導致其中樞神經系統功能紊亂[8],給當地的畜牧業帶來嚴重影響。同時,冰川棘豆也是高寒草原和荒漠主要伴生種之一,可以在局部環境或者退化草地中形成優勢種或亞優勢種,對青藏高原草地退化以及土地荒漠化產生嚴重影響[9]。目前關于冰川棘豆的研究多集中于生態毒理、生物堿和內生菌等方面,趙寶玉等[10]人對西藏阿里地區的冰川棘豆分布面積、生物學特征、危害情況以及動物中毒特征進行了全面調查,李勤凡等[11]對冰川棘豆中生物堿進行了提取并鑒定為苦馬豆素,余永濤等[12]已經從冰川棘豆中分離出了產苦馬豆素內生真菌棘豆埃里格孢菌,張峰華等[13]對冰川棘豆產苦馬豆素內生真菌相關的調控基因和酶進行了篩選,但是對青藏高原冰川棘豆根系土壤微生物的研究幾乎是空白。冰川棘豆根系土壤是否存在提高植物抗寒、抗旱、抗輻射、耐鹽堿和抗缺氧機制的微生物種群有待研究,冰川棘豆是否通過根系分泌物影響根系土壤微生物種群結構,使其成為局部環境中的優勢群落也待驗證。

本研究以青藏高原不同生態環境的冰川棘豆根系土壤細菌為研究對象,分析了不同生態環境中冰川棘豆根系土壤細菌的群落多樣性及其與土壤理化因子的關系,闡述了其空間分布規律,探討了根系土壤細菌對冰川棘豆在高寒生態系統中形成優勢種可能的影響。

1 研究區域與材料方法

1.1 研究區域概括

本研究地理位置信息見表1。羊八井鎮位于地熱資源豐富的羊八井盆地,措勤縣扎日南木措位于青藏高原北部羌塘國家級自然保護區,扎布耶措是中國最大的鉀鹽湖,珠峰大本營位于珠穆朗瑪峰國家級自然保護區核心區,上述地區是冰川棘豆的主要分布區,屬于高原寒帶和亞寒帶季風半干旱氣候[14],本次科學考察取樣獲得西藏自治區林業廳及各自然保護區主管部門批準。

表1 采樣點信息

1.2 樣地設置與取樣方法

本研究于2017年8月冰川棘豆生長旺盛期進行采樣,每個樣點3個重復,每個重復間隔100 m以上,共采集11份樣本,其中ZBY樣點因樣本采集困難,只采集了2個樣本。采樣時,將冰川棘豆整株挖起,抖動脫落土,脫落土用無菌袋封裝,用于土壤理化性質測定。將根表面粘附的土壤洗脫至 95%乙醇中,放入-20℃車載冰箱(美固Mobicool,CF- 50)中帶回實驗室置于-80℃超低溫冰箱(江蘇盛藍,DW86L- 158)冷凍保存,用于土壤細菌總DNA提取。

1.3 土壤理化性質分析

按如下方法對有機物(organic matter,OM)、速效鉀(available K,AK)、速效磷(available P,AP)、銨態氮(ammonium N,AN)、pH、電導率(electrical conductivity,EC)和含水量(soil moisture,SM)等土壤理化因子進行檢測,含水量用烘干法測定,稱取5 g新鮮脫落土于培養皿,置于(105±2)℃恒溫干燥箱(上海精宏,DK- 420S)中烘干8 h；pH用電位計法測定(哈納HANNA,HI98103),水土比為1∶1；電導率用電導儀法測定(哈納HANNA,HI98304),水土比為3∶1；有機物、速效鉀、速效磷、銨態氮用便攜型土壤成分測定儀(北京優普通用,UPA-B506)測定[15]。

1.4 根系土壤細菌總DNA提取及測序

采用SDS加酶法提取根系土壤細菌總DNA[16],用NanoDrop One(Thermo,NanoDrop One)檢測DNA純度和濃度,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)與806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rDNA V3-V4區進行PCR擴增[17]。PCR采用 20 μL反應體系,其中10×Bufferv 2 μL,2.5 mM dNTPs 2 μL,雙向引物各(5 μM)0.8 μL,rTaq 聚合酶0.2 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,補ddH2O至20 μL。PCR反應參數為：95℃ 3 min；95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 45 s,25個循環；72℃ 10 min,10℃停止試驗[18]。用NanoDrop One檢測PCR產物純度和濃度,樣本送至廣東仁秀測序公司(Rgenome,China) 通過Illumina HiSeq平臺進行高通量測序。

1.5 數據分析

使用FLASH軟件(FLASH v1.2.7)對每個樣本Illumina HiSeq測序得到的雙端序列進行拼接,得到原始的操作分類單元OTUs(Operational Taxonomic Units)數據(Raw Tags)。用Trimmomatic(v0.33)軟件對拼接后的Raw Tags質量和效果進行質控過濾,得到高質量的Tags數據(Clean Tags)。所得Clean Tags數據在美吉公司I-Sanger云平臺(www.i-sanger.com)上進行分析。利用Usearch(vsesion7.0)軟件在Silva(Release128 http://www.arb_silva.de) 數據庫基于97%相似度下對OTU聚類分析和物種分類學分析。利用ANOSIM相似性分析和Adonis置換多因素方差分析對四組樣本進行分析,判斷分組的可行性和可信度,然后基于最小樣本序列數進行了抽平。Alpha多樣性方面,利用mothur (version v.1.30.1)對Ace、chao、coverage、shannon和simpson五個指數進行分析,用T檢驗分析指數差異,用R作圖。菌群結構組成方面,通過柱形圖表示細菌群落組成；通過Venn圖比較分析,在屬的水平上確定四組樣本共有的優勢菌群；通過One_way ANOVA單因素方差分析各組樣本屬水平的差異物種組成,P值多重檢驗校正設置為Fdr、Post-hoc檢驗scheffe顯著水平值為0.95。菌群結構關聯與模型預測方面,采用Network共現性網絡分析和相關性網絡分析進行分析。土壤理化因子與菌群的關聯分析方面,檢測了OM、AK、AP、AN、pH、EC和SM,進行了CCA典型分析；基于Spearman等級相關系數,繪制了豐度前50的屬與土壤理化因子的相關性Heatmap圖。利用AI(Adobe Illustrator CS6)和PS(Adobe Photoshop CS6)軟件對圖片進行了組合處理。

所有的測序原始數據已提交到GenBank項目登錄號PRJNA506831和NCBI SRA(Sequence Read Archive)登錄號SRP170620下。

2 結果與分析

2.1 測序結果及Alpha多樣性統計分析

2.2.1測序結果

通過高通量測序共得到725599條原始序列,質控后得到531512條高質量序列,平均每個樣本48319條,在97%的相似水平下注釋得到的OTUs數量為8743,統計共得到35個門,94個綱,195個目,368個科和712個屬。平均Coverage覆蓋率為96.2%,Shannon稀釋曲線均趨于平緩(圖1),說明本研究的測序數據合理,更多的測序數據只會產生少量新的物種OTU,基本能反應樣本中細菌的群落結構組成。ANOSIM相似性分析顯示組間差異大于組內差異(R=0.6444),分組是可行的；Adonis置換多因素方差分析顯示分組可信度高(P=0.001)。

圖1 Shannon稀釋性曲線及多樣性指數差異

2.1.2Alpha多樣性統計分析

從表2可以看出,Ace和Chao豐富度指數以YBJ的最高,ZBY的最低,菌群豐富度排序為：YBJ>CQ>ZF>ZBY；Shannon和Simpson多樣性指數以CQ最高,ZBY最低,菌群多樣性排序為：CQ >YBJ >ZF>ZBY。組間指數T檢驗結果顯示(圖1),YBJ、CQ和ZF樣本的多樣性組間差異不明顯,ZBY與其他組多樣性組間差異顯著。YBJ和ZBY之間有顯著差異(P<0.05),其他組間Shannon指數差異不顯著(P>0.05)。

表2 冰川棘豆根系土壤細菌的物種豐富度和多樣性指數

表中多樣性指數數據為：平均值±標準偏差；OTUs：操作分類單元(Operational Taxonomic Units)；Ace：Ace指數；Chao：Chao指數

2.2 冰川棘豆根系土壤細菌群落物種組成分析

2.2.1門和屬水平的根系土壤細菌群落結構

根據分類學分析結果,除0.79%的未確定類群外,其余樣本共注釋到共35個門(圖2),平均相對豐度在前1%的門比例為95.14%,包括變形桿菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和螺旋體門(Saccharibacteria)。經統計,除Hydrogenedentes在CQ特有,FCPU426,Lentisphaerae,Candidatus Berkelbacteria,BJ_169在ZF特有,其他門在四組樣品中均有分布。

在屬的水平分析結果顯示,所有樣本共注釋到712個屬(圖2),平均相對豐度在前1%的物種分布在9個門的23個屬,占所有屬42.81%的比例。YBJ以Sphingomonas(7.26%)、Solirubrobacter(4.78%)和Planctomycetaceae(4.47%)為主；ZF以Prevotella9(7.98%)、RB41(5.09%)和Acidobacteria(4.92%)為主；ZBY以Arthrobacter(12.45%)、Micrococcaceae(5.86%)和Sphingomonas(5.33%)為主；CQ以Acidobacteria(6.41%)和G30-KF-CM45(4.29%)為主。YBJ特有屬為Acidiphilium,Rhodovarius和Dokdonella等；ZF特有屬為Geobacter,RuminococcaceaeUCG_013和BacteroidalesS24_7等；ZBY特有屬為Azotobacter,Nibribacter,Agromyces,Rufibacter和Deinococcus等；CQ特有屬為Limnobacter,CA002和NB1-j等。其中Arthrobacter在ZBY為主要優勢菌屬(12.45%),在YBJ(0.40%)和CQ(0.14%)少量分布,在ZF樣本中無分布。Venn顯示四組樣本共有屬257個(36.20%),YBJ樣本特有屬43個(6.06%),ZF樣本特有屬28個(3.94%),ZBY樣本特有屬23個(3.24%),CQ樣本特有屬79個(11.13%)(圖2)。

2.2.2根系土壤菌群落組間差異分析

在屬的水平上,對在四組樣本間相對平均豐度差異較大的15個物種進行的單因素方差分析(One_way ANOVA)及post_hoc檢驗結果表明(圖2),四種生態類型下Solirubrobacter、TK10、0319_6M6和Elev16S_1332存在極顯著差異(P<0.01),Micrococcaceae、Saccharibacteria、JG30KF_CM45、Gaiellales、Acidimicrobiaceae、Blastococcus、Solirubrobacterales、Frankiales、Bradyrhizobium、Patulibacter和Parcubacteria存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 基于門和屬水平的細菌群落結構及屬水平的venn圖

2.3 冰川棘豆根系土壤細菌群落結構關聯與模型預測分析

2.3.1共現性網絡分析

對所有樣本進行共現性網絡分析顯示,樣本與物種共有1455個有效節點(Degree) (圖3A),YBJ、ZF、ZBY和CQ樣本分別有319、411、340和385個節點,與四組樣本均共線的屬中約30.70%,至少有67.28%的屬在兩組以上的樣本中共線。四組樣本中有7個屬共線率超過2%,包括Sphingomonas(4.79%)、Acidobacteria(4.02%)、Arthrobacter(3.28%)、Micrococcaceae(3.03%)、Prevotella9(2.42%)、Planctomycetaceae(2.22%)和RB414(2.07%)；有17個屬共線率超過1%,包括KD4_96、Acidimicrobiales、Lactobacillus、Solirubrobacter、Saccharibacteria、Comamonadaceae、Sphingomonadales、JG30_KF_CM45、GittGS_136、Iamia、Gemmatimonadaceae、Gaiellales、Segetibacter、Rubellimicrobium、TK10、Gaiella和Nitrosomonadaceae。以上共線率大于1%的24個屬,確定為冰川棘豆根系土壤細菌群落的核心菌群。

2.3.2相關性網絡分析

相關性網絡分析發現(圖3B),在網絡中共顯示有37個節點和212條邊,說明冰川棘豆根系土壤細菌群落存在高水平的連接性。豐度大的物種在相關性網絡中不完全占主導地位,整體群落的協同作用大于拮抗作用,Latescibacteria協同作用最明顯,而Actinobacteria拮抗作用最明顯。Latescibacteria、Actinobacteria、Chlorobi、FBP、Candidatus_Berkelbacteria、TM6、Parcubacteria、Acidobacteria和Peregrinibacteria九個門相關性較大,在整個菌群網絡中起到了關鍵的作用。Latescibacteria和Actinobacteria是最關鍵的門,Latescibacteria、Chloroflexi、TM6、Peregrinibacteria、Acidobacteria和Peregrinibacteria與其他門均呈正相關；Actinobacteria、FBP、Cyanobacteria與其他門呈負相關,Actinobacteria是負相關最大的門。

圖3 共線性網絡和相關性網絡分析圖

2.4 土壤理化因子對根系土壤菌群的影響

不同樣本的根系土壤理化因子見表3。通過VIF方差膨脹因子分析篩選發現OM、AK、AP、AN、pH和SM 6個土壤理化因子與根系土壤菌群結構顯著相關,能夠最大程度體現對根系土壤菌群的影響。

表3 冰川棘豆根系土壤基本理化因子分析

表中土壤理化數據為：平均值±標準偏差,“—”表示相關作用不顯著的環境因子,VIF：方差膨脹因子

2.4.1典范對應分析

CCA分析結果表明(圖4),第一排序軸(CCA1)解釋度為19.61%,與有機物、pH、銨態氮、含水量、速效鉀和速效磷的相關性系數分別為-0.77、0.54、-0.97、-0.84、0.97和-0.37；第二排序軸(CCA2)解釋度為14.17%,與有機物、pH、銨態氮、含水量、速效鉀和速效磷的相關性系數分別為-0.63、0.84、-0.25、-0.53、0.26和-0.93,兩軸共同解釋了物種構成變化的31.78%。根系土壤菌群豐度與有機物和pH極顯著相關(P<0.01),與銨態氮、含水量和速效鉀呈顯著相關(P<0.05),與速效磷相關性不顯著,有機物和pH是冰川棘豆根系土壤菌群豐度空間變異的最主要驅動因素。pH、有機物、速效鉀、銨態氮、含水量和速效磷對群落物種分布的決定系數(R2值)分別為0.88、0.86、0.84、0.67、0.63和0.35。

圖4 基于屬水平的CCA分析

2.4.2土壤理化因子與菌群相關性Heatmap圖

通過計算土壤理化因子與菌群之間的Spearman等級相關系數發現(圖5),12個屬豐度與土壤理化因子呈顯著正相關,13個屬豐度與土壤理化因子呈顯著負相關,具體為：Nitrospira和KD4_96與銨態氮顯著正相關,0319_6M6、Microvirga、Nocardioides和Methylobacterium與速效磷呈顯著正相關,Gitt_GS_136和OM1_clade與速效磷呈顯著負相關；Planctomycetaceae、Solirubrobacter、0319_6M6 、Planctomycetaceae和Solirubrobacterales與含水量呈顯著正相關；Planctomycetaceae、Solirubrobacter和TK10與有機物呈顯著正相關,Saccharibacteria與有機物呈顯著負相關；Micrococcaceae與速效鉀呈顯著正相關,AKIW781、Nitrospira、JG30_KF_CM66 和Acidimicrobiaceae與速效鉀呈顯著負相關；Planctomycetaceae、Solirubrobacter、Gaiellales、Solirubrobacterales、0319-6M6和Ferruginibacter與pH呈顯著負相關。

圖5 土壤理化因子與菌群相關性Heatmap圖

3 討論

3.1 根系土壤細菌多樣性指數

青藏高原高寒生態系統中植物根部土壤微生物菌群豐度與群落結構組成具有很大獨特性[19],同一區域不同植被類型[20]或不同區域同一植被類型[21]的土壤微生物多樣性具有一定差異,對青藏高原高寒生態系統氣候變化的影響具有重要意義[22,23]。本研究發現,冰川棘豆根際土壤細菌群落多樣性在不同生態環境下表現出一定特征,四種生態環境中菌群結構組成穩定在24個類群左右,而在菌群豐度上差異較大,高寒草原、高寒退化草原、高寒荒漠的菌群豐度高、差異小,高寒鹽漠的菌群豐度與其他三種生態環境差異較大。形成這種特征的原因可能是由于四個樣品采集點海拔在4287—5003 m之間,均屬于極端環境,不同生態環境的冰川棘豆在長期適應下,其根系土壤細菌群落結構組成趨同且穩定,而菌群豐度隨著植物根部代謝產物補給量和土壤理化因子的變化而變化。不同地區植物根部土壤微生物群落結構組成在門水平較為相似,在綱和屬等分類級別下出現較大差異[24],本研究中,四個地區的生態環境特征及土壤理化性質有所差異,但在同一植物冰川棘豆根系土壤細菌主要類群上,體現出高度重疊,在門的層次相似度較高,物種進化方向保持相對一致,隨著分類級別的提高,物種相似度降低,菌群屬水平豐度有所變化,但優勢菌群仍然表現出較大的相似度。

3.2 根系土壤細菌群落物種組成特征

植物會主動選擇根部土壤的細菌群落的結構組成[25],抗逆性極強的多年生植物冰川棘豆根系可達到60—100 cm[9],發達的根系有益于在根系土壤中形成穩定的菌群結構[26]。變形桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等在冰川棘豆根系土壤中形成了優勢類群。近年來,相關學者對水稻[27]、尼泊爾黃堇[28]、擬南芥[29]和玉米[30]等植物根部土壤細菌群落結構的研究發現,優勢菌群分布在變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門、浮霉菌門和芽單胞菌門等類群中,我們得到的結果與以上研究類似。冰川棘豆屬于豆科植物,豆科植物根部土壤的氮素含量較高,所以根系土壤微生物數量也較多[31],包含有多種固氮菌的變形菌門在冰川棘豆根系土壤中豐度最高,可耐受干旱、低溫等極端條件的厚壁菌門[32],在冰川棘豆根系土壤中豐度也較高。Aschenbrenner等根據微生物Nerwork共現性網絡分析發現,地衣、苔蘚[33]和樹皮[34]的最核心菌群為Proteobacteria,我們利用該方法,成功構建了24個菌屬組成的冰川棘豆根系土壤細菌核心菌群,核心菌群對保持菌群的多樣性和穩定性、研究冰川棘豆在極端環境的適應性進化以及與其根系土壤微生物互作極其重要。Barberán等[35]通過相關性網絡分析發現,某些與其他菌群關系密切種屬在維持菌群結構與功能中最為關鍵,我們的研究發現核心菌群中發揮作用關鍵的菌屬在不同的類群之間關系復雜,在極端環境下,植物根系土壤細菌群落更趨向于緊密的協同作用,因此菌群整體表現出協同作用大于拮抗作用的趨勢。在Wang等[36]的研究中發現Arthrobactersp. HW08能夠高效降解冰川棘豆苦馬豆素,在本研究中Arthrobacter是冰川棘豆根系土壤細菌的主要核心菌群之一,并且在扎布耶鹽湖地區的冰川棘豆根系土壤細菌中是豐度最高的菌屬,這對揭示冰川棘豆根系微生物在極端環境下的適應性進化機制具有重要作用。

3.3 土壤理化因子對根系土壤菌群多樣性的影響

土壤理化因子的差異使得不同區域的植物根部土壤微生物趨于多樣性和差異分布[37],Mitter等[38]發現,不同地區的大麥和草木樨的根部土壤細菌群落組成存在明顯的差異。本研究中,每個生態環境下的菌群聚在一起,羊八井、措勤和珠峰三地生態類型屬于高寒草原退化過程中的不同階段,故菌群相似度較高；扎布耶措屬于高原鹽漠,離散于其他生態類型之外,與其他生態類型的菌群差異較大。在我們研究中,不同的土壤理化因子對菌群相對豐度的正負相關影響不同,如在氮循環過程中的具有消化功能的硝化螺旋菌屬Nitrospira[39]與銨態氮呈顯著正相關；具有溶磷功能且與豆科植物根瘤形成相關的甲基桿菌屬Methylobacterium[40]與速效磷呈顯著正相關；具有厭氧氨氧化功能的浮霉菌Planctomycetaceae[41]與含水量呈顯著正相關,可促進植物生根的壤紅桿菌屬Solirubrobacter[42]與含水量和有機物呈顯著正相關；Planctomycetaceae、Solirubrobacter和Gaiellales等對pH變化敏感,與Sy等[43]的研究結果一致。有研究表明,植物根部土壤細菌群落結構組成與多樣性主要受土壤pH和有機物的影響[44,45],本研究同樣表明,在極端環境中pH和有機物對冰川棘豆根系土壤微生物菌群相對豐度影響最大。

4 結論

綜上所述,不同生態環境中的冰川棘豆根系土壤細菌多樣性豐富,保持了穩定的核心菌群,對冰川棘豆在高寒生態系統中形成優勢種具有促進作用。菌群在適應極端環境的過程中,不同環境中的土壤理化因子會驅動菌群相對豐度發生變化,受土壤pH和有機物影響最大,從而使得菌群相對豐度在空間分布上產生差異。在下一步的研究中需要擴展研究尺度,檢測土壤類型、粒度等更為全面的土壤理化性質和氣候因子等數據,從多組學相互作用的層面分析冰川棘豆與其根系土壤微生物之間在功能上的關系,進一步了解根系土壤微生物對冰川棘豆在高寒生態系統中形成優勢種的適應性進化機制,為青藏高原草地退化和荒漠化治理提供參考依據。