核磁共振擴散序譜的研究及應用進展

張 鵬，陳 媛，羅 維*

(1.華南理工大學 分析測試中心，廣東 廣州 510641;2.工業和信息化部電子第五研究所 電子元器件可靠性物理及其應用技術重點實驗室，廣東 廣州 510610)

液相擴散系數是研究分子傳質過程、傳質速率的重要基礎數據。自擴散系數的大小與溶質分子的結構及其所處介質環境有關。通過測定自擴散系數，可以定性或定量表征液相分子的相關物理化學性質，例如分子尺寸、分子量、聚集狀態及分子間相互作用等。核磁共振技術是化合物結構及成分測定的有效手段，在物理、化學、生物、醫藥、食品等領域得到了廣泛應用。1950年，Hahn提出“自旋回波”的概念[1]，并闡明了在非均勻磁場中擴散效應對回波幅度的影響，奠定了核磁共振擴散研究的理論基礎。隨著核磁共振技術軟硬件的發展，基于脈沖場梯度(Pulsed field gradient ,PFG)的核磁共振研究以其快速、無損、樣品用量少、受雜質影響小等特點，成為測量液體及溶液樣品自擴散系數的重要手段。

1991年，Johnson等率先開發了一種用于直觀展現擴散系數的偽二維譜[2]，即擴散序譜(DOSY)。其中一維是化學位移，另一維是擴散系數(D或者logD)，可分別通過衰減信號的傅立葉變換和拉普拉斯變換產生，且不同分子的信號按照擴散系數大小依次排序。由于DOSY非常適合用于分析溶液中的小分子混合物與生物分子，因而很快為化學、生物等領域的科學家所接受。二維DOSY中最常用的是1H-DOSY，因為1H原子核具有較大的磁旋比，天然豐度高、信號強。但1H NMR譜寬較窄，在某些復雜混合物中信號重疊嚴重。為了提高化學位移維的分辨率，研究人員將DOSY實驗拓展到其他原子核，例如：7Li、13C、19F、23Na、31P、119Sn、133Cs、195Pt等等[3-9]。與氫核相比，這些原子核的化學位移范圍更寬，弛豫時間長、線寬窄、無自旋耦合(或很少自旋耦合)，能夠顯著提高DOSY譜圖的分辨率。但其磁旋比較低，梯度效率損失過大。王英雄課題組[10]利用低溫1H- 和19F-DOSY研究糖基化反應中的活性中間體，19F-DOSY大大降低了譜圖的復雜程度，提供了更多關于反應路徑的信息。

Gorenstein首先提出了三維DOSY(3D-DOSY)的概念[11]，并將DOSY與二維譜奧氏核效應效換相關譜(NOESY)聯用，成功地解決了DNA雙鏈體和二核苷酸譜峰重疊的問題。此后，3D-DOSY 發展迅速，幾乎所有類型的二維譜都能與DOSY結合使用，例如：同核化學位移相關譜(COSY)[12-14]、全相關譜(TOCSY)[15-16]、異核單量子相關譜(HSQC)[16]、異核多量子相關譜(HMQC)[17]和J分辨譜(J-Res)[14,18]等。DOSY可以區分擴散系數差異為1%的化合物。但在信號重疊時，DOSY的效果不佳，此時需要借助分子間相互作用，擴大被分析物擴散系數的差別。通常的做法是向混合物中加入更多的共溶質或基質，以選擇性地調節分子的擴散行為[19-21]，最終實現擴大各組分擴散系數差異的目的，這種方法被稱為基質輔助DOSY。合適的基質是實驗成功的關鍵，常見的基質[19]有硅納米粒子類、聚合物類、表面活性劑類、微乳液類，等等。黃少華等[22]研究發現聚二甲基硅氧烷(PDMS)對大部分類型有機分析物都具有顯著的分離能力，是一類理想的通用型基質。基質輔助DOSY可用于同分異構體的分析，包括分離位置異構體、對映異構體、差向異構體等。例如王英雄等[23]以Ga2+離子為基質，成功區分出D-葡萄糖的α-和β-端基異構體。

目前DOSY實驗主要應用于以下4個方面：(1)用于復雜混合物的成分分析。依據不同分子擴散快慢，鑒定藥物[24-26]、膳食補充劑[27-28]、食品[29-32]、飲料[33-38]以及生物提取物[39-43]中的各基質成分；(2)測量分子的大小[44-46]，例如納米顆粒尺寸等；(3)測量分子量[47-53]，例如高分子聚合物中的分子量分布等；(4)研究化學、生物系統中溶液分子間的相互作用[54-55]，評估主體與客體分子之間的締合常數[56-57]。

圖1 脈沖場梯度自旋回波(PFGSE)序列[58]Fig.1 Pulsed field gradient spin echo(PFGSE) sequence[58]red,green and blue represent the gradient pulse intensity of 2%,50% and 95%,respectively(紅、綠、藍分別代表2%、50%、95%的梯度脈沖強度)

1 脈沖場梯度及脈沖序列的發展

1.1 脈沖場梯度

脈沖場梯度是DOSY實驗的基礎，可以在分子擴散運動與場梯度強度之間建立明確的數學關系。圖1所示是1H-DOSY實驗最基礎的脈沖場梯度自旋回波(PFGSE)序列，由射頻脈沖及場梯度脈沖組成。場梯度的主要作用是進行空間定位，包括相位編碼及頻率編碼，可通過場梯度明確空間上的任意位置。而射頻脈沖主要用于發射及采集信號，通過回波信號來了解樣品的特性。

圖2描述了PFGSE脈沖序列下，原子核磁化強度矢量的演化行為，圖1和圖2中不同強度的梯度脈沖通過顏色一一對應。第一個標準90°x射頻脈沖將磁化強度矢量沿x-y平面的x方向對齊(黑色箭頭)，各自旋相位相干。第一個梯度脈沖將磁化強度矢量沿x-y平面和z軸扭曲為螺旋形狀，即編碼。所謂“編碼”指脈沖場梯度通過與空間呈線性關系的相位角，記錄各自旋所處的位置。磁化強度矢量的螺旋程度取決于梯度脈沖的強度和脈寬。兩個梯度脈沖之間的時間稱為擴散時間Δ(紫色)，樣品在該段時間內進行自擴散，不同組分按各自速率自由擴散。擴散時間Δ期間，施加一個180°x射頻脈沖，有抵消磁場不均勻性的作用。演化時間之后，通過第二個梯度脈沖“解碼”。因此，磁化強度矢量的相位變化是兩次梯度脈沖以及180°x射頻脈沖共同作用的結果。在沒有擴散作用及橫向弛豫的理想情況下，螺旋會被完美的退繞并返回同相自旋，從而可以探測到最大回波信號。在實際情況下，由于分子擴散等作用的影響，兩個梯度脈沖引起的相位變化不會完全抵消。僅一部分的磁化強度矢量(較小的箭頭/圓圈)被第二個解碼脈沖恢復(顏色編碼與第一個梯度脈沖的梯度強度匹配)。因此，擴散會導致信號強度降低，信號衰減取決于螺旋螺距Λ，即取決于梯度脈沖強度(g)和脈寬(δ)，公式表達為：

I=I0exp[-Dγ2g2δ2(Δ-δ/3)-R]

(1)

I為觀察到的信號強度，I0為不加場梯度時的信號強度，D為擴散系數，γ為旋磁比，Δ為擴散時間，R為考慮弛豫的常數項，對于PFGSE脈沖序列而言，R=2τ/T2(τ為射頻脈沖間隔時間，T2為橫向馳豫時間)。如圖2所示，梯度功率越高(綠色：50%，藍色：95%)回波信號強度越小。改變梯度脈沖強度g，可采集到衰減程度不同的一組譜峰，經指數擬合便可求得擴散系數D。通過對化學位移軸上數據點對應的擴散系數進行拉普拉斯變換[59]，可得到二維DOSY譜，f1維代表擴散系數(D或者logD)，f2維代表化學位移。

圖2 磁化強度在PFGSE脈沖序列下的演化過程圖示[58]Fig.2 Evolution process of magnetization under the PFGSE pulse sequence[58]

圖3 基于場梯度的脈沖序列[55]Fig.3 Pulse sequence based on field gradient[55]A.SE[60]；B.STE[61]；C.LED[2]；D.BPPLED[63]

1.2 DOSY脈沖序列研究進展

隨著連續波核磁共振波譜發展為脈沖傅立葉變換波譜，核磁共振擴散研究在脈沖序列開發上取得了長足的進步，圖3給出了幾種常見脈沖序列的時序圖。Tanner和Stejskal率先實現了基于脈沖場梯度的自旋回波實驗[60]，采用的脈沖序列簡稱為PFGSE(Pulsed field gradient spin echo)。該脈沖序列遵從自旋-自旋弛豫，即橫向弛豫T2。對于某些研究對象(例如黏度較大的高分子溶液等)，橫向弛豫時間過短，遠小于測量所需的分子擴散演化時間(通常為幾百毫秒量級)，從而導致回波信號嚴重衰減、難以檢測。為了解決這個問題，Tanner提出了基于脈沖場梯度的受激回波PFGSTE(Pulsed field gradient stimulated echo)[61]脈沖序列。在該脈沖序列作用下，磁化矢量大部分時間在z軸演化，橫向弛豫T2的影響減小，縱向弛豫T1占據主導[62]。對于大多數T1≥T2的體系，該序列能減小弛豫時間對信號強度的影響，因此大大提高了實驗靈敏度。

早期核磁共振譜儀的探頭使用大量金屬材料，但梯度脈沖的快速上升/下降會在探頭內部產生“渦流”，導致譜圖相位畸變、譜峰重疊。Gribbs等在PFGSTE序列的基礎上，開發了縱向渦流延遲脈沖序列LED(Longitudinal eddy-current delay)，大大提高了DOSY實驗的準確性和重復性[2]。Wu等[63]將雙極梯度脈沖(BPP)與LED組合使用，成功地減小了95%的渦流。與LED實驗相比，BPPLED脈沖序列將有效梯度輸出增加了一倍，能用來測量相對較低的擴散系數。近年來商業化探頭的屏蔽越來越成熟，梯度技術不斷提高，渦流的影響已微乎其微，使用常規的自旋回波(SE)、受激回波(STE)脈沖場梯度序列即能得到很好的實驗結果。另一方面，NMR脈沖設計的經驗法則是，更多的脈沖等于更低的靈敏度[58]。如果實驗不需要用到長脈沖序列的某些特殊優點，那么應盡量避免選擇很長的脈沖序列，以提高信噪比、縮短實驗時間。因此，LED和BPPLED序列的使用有所減少。

核磁管中的對流是影響實驗結果的另一個重要因素，低黏度、低沸點的溶劑(例如：氯仿)易受溫度梯度影響，產生對流，影響數據質量。Müller等[64]設計了兩個串聯的PFGSTE脈沖序列，可以有效地消除對流影響。布魯克譜儀采用了這種設計，其標準脈沖程序庫中的dstebpgp3s序列包含一個雙STE片段，該片段具有3個擾流梯度[64]，非常適合處理核磁管中的對流，但靈敏度不高。劉買利等[65]提出了基于雙PFGSE的雙脈沖梯度場多自旋回波(DMSE)序列，可以有效地消除溶劑對流、背景場梯度、自旋-自旋耦合等因素的影響，準確測定小分子代謝物的擴散系數，適用于復雜生物樣品。隨著核磁共振技術的不斷發展，越來越多的脈沖序列被開發出來，用于滿足擴散實驗現實應用的需要，例如：減小J耦合影響[66-67]、壓制溶劑峰[68]、減少相位循環[69-70]、擴大擴散系數測量范圍[71-72]等。研究人員可以根據樣品特點及需要，選擇合適的脈沖序列。

值得注意的是，實驗參數的設置對測試結果有較大影響，主要影響因素[58]包括：脈沖序列類型、場梯度脈沖強度g、擴散延遲時間Δ、脈寬δ、梯度步長、擴散擬合程序等等。研究人員有必要深入了解研究對象與脈沖程序之間的匹配程度，針對不同類型的樣品，選取合適的信號采集及處理程序。

2 應用領域及研究進展

2.1 擴散系數D

溶液中分子的擴散速度受分子大小、形狀、分子量以及濃度、溫度、溶劑等因素的影響。當外界條件固定時，不同種類的分子在相同環境中將表現出不同的擴散系數，基于此可以區分混合物中的各個組分，例如：藥物、膳食補充劑、食品和其他復雜物質(植物提取物、動物/人類生物基質等)。2005年以來，已有多篇DOSY用于混合物鑒別的綜述，內容非常詳盡[56,73-75]，本文簡單介紹其中幾種典型的應用。

在藥物領域，DOSY常用于鑒別假冒偽劣制品，例如抗生素[76]、抗抑郁藥[77]、緊急避孕藥[78]、抗瘧藥[79]等。DOSY可同時提供活性藥物成分(API)和賦形劑的信息，給出藥物制劑各組分的化學指紋。研究人員發現市場上偽造最多的是用于治療性功能障礙的藥物[80]，例如“西力士”和“偉哥”。將真品藥物與仿制藥進行比較，大多數制劑都含有效的API成分，正品與仿制品之間的區別在于含有不同的賦形劑。而某些緊急避孕片劑[78]、抗瘧疾[79]藥物中，含有錯誤的API甚至不含API，將會嚴重影響服用者的健康。在我國某農村地區出現了一種名為“止痛膠囊”的藥品，未標明成分及含量，存在用藥安全隱患。鄧志威等[81]通過DOSY測試手段發現其中4種主要成分，結合其他譜圖確定其API成分為對乙酰氨基酚、布洛芬。

中草藥化學成分復雜，需經過繁瑣的分離純化過程以鑒別其中的活性成分。本課題組[82]對余甘子活性成分進行了提取分離，利用一維、二維NMR鑒定了18種化合物結構。唐亞林等[83-85]借鑒組學概念，將DOSY與生物靶分子的識別結合，進行天然抗腫瘤化合物的快速篩選和結構鑒定。在川黃柏皮、黃連根莖等提取物溶液中加入生物靶分子，活性小分子與大分子結合后擴散變緩，兩者對應信號處于相同擴散帶，由此明確了活性小分子的特征譜峰，進一步通過HSQC、異核多鍵相關譜(HMBC)實驗鑒定了活性小分子的結構。陳忠等[86]應用DOSY原位分析丹參混合液，高效、準確地確定了其主要成分丹參素鈉、丹參酮。陳福欣等[87]利用DOSY詳細研究了黃芪和左金丸對α-糖苷酶的抑制作用。

在高分子領域，DOSY常被用于評估共聚物的聚合狀態。若DOSY譜圖中顯示多組不同擴散系數的信號，表明共聚物中存在單體雜質或均聚物混合物。本中心核磁組為多個課題組提供了DOSY測試支撐[88-90]，以丙交酯(LA)、環氧乙烷(EO)、酞酐(PA)的三元共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA為例[88]，如圖4A所示，聚丙交酯(PLA)、環氧乙烷與酞酐交替共聚物P(PA-alt-EO)的混合物表現出兩組不同擴散系數的信號，D=1.86×10-10m2/s處歸屬為P(PA-alt-EO)，D=1.37×10-10m2/s處歸屬為PLA，與之相對應的是三元共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA在圖4B上只呈現一組信號(D=1.41×10-10m2/s)。結合核磁氫譜、排阻色譜等實驗手段，證明成功制備了該三元共聚物。

圖4 PLA與P(PA-alt-EO)摻雜的混合物(A)及反應后的三嵌段共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA(B)的1H-DOSY譜圖[88]Fig.4 1H-DOSY spectra[88]of a blend of P(PA-alt-EO) and PLA(A) and the PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA triblock terpolymer(B)

擴散系數的改變也能反映分子絡合或組裝程度的變化。在主客體識別的體系中，往往通過改變物質的濃度、觀察擴散系數隨濃度的變化來表征分子間相互作用、微觀結構的變化。以微乳液為例[91-92]，O/W型微乳液中Doil?Dwater(通常Doil為10-11m2/s量級，Dwater為10-9m2/s量級)，W/O型微乳液中Dwater?Doil，在雙連續型微乳液中Dwater和Doil都很高(約為10-9m2/s)，并且數值非常接近。如果水和油的相對D值相差一個以上數量級，則意味著緩慢擴散溶劑中含有離散顆粒；如果它們具有相同的數量級，則意味著存在雙連續結構。

2.2 流體動力學半徑RH

DOSY可用于測量納米粒子[93]、表面活性劑膠束[94]、脂蛋白[33-34]、超分子聚集體[35-36]、低聚糖[95]等粒子的尺寸。粒子尺寸與擴散系數密切相關[44-46]，可以利用斯托克斯-愛因斯坦公式(2)來估算擴散粒子的流體動力學半徑(也稱為斯托克斯半徑)RH：

RH=kT/(6πηD)

(2)

式中，k是玻爾茲曼常數，T是絕對溫度，η是介質的粘度。公式假設一個膠體尺寸的硬球形顆粒(直徑遠高于溶劑的球形顆粒)在連續流體中勻速移動。對于較大形狀的分子，其分子各個軸向的差異并不大，因此，公式(2)可以用來估算RH的合理近似值。

以金納米顆粒為例，納米顆粒在材料、物理、電氣工程和生物醫學工程等領域具有廣泛應用，其大小和納米顆粒的表面化學性質是兩個關鍵參數。通常，納米粒子的大小由電子顯微鏡確定，表面化學性質利用光譜學來表征，例如紅外和拉曼光譜。Yarger課題組[93]利用DOSY等核磁共振波譜對金納米顆粒的尺寸、表面化學性質和結構進行了表征，為納米顆粒的尺寸測定和表面化學研究建立了更先進、便捷的方法。值得注意的是：通過擴散系數定量的納米顆粒尺寸，往往與透射電鏡測量的尺寸有差異，且比電鏡測量尺寸稍大。這是因為電鏡主要專注于測量金屬核的物理尺寸，而DOSY則考慮了與納米顆粒表面結合的配體，測量對象是溶液中粒子的有效水合直徑。

2.3 分子量Mw

DOSY可用于測定聚合物[58]、多糖[48]、蛋白質[96]等的分子量分布，依據所使用的標準物質，大致可分為內標法和外標法兩種。外標法需選擇合適的參考物質，通常是結構與待測物相似的已知化合物。首先測量出參考化合物擴散系數D與分子量Mw的雙對數關系圖。然后在相同的實驗條件下，測量未知化合物的D值，將其帶入標準曲線中，推導出未知化合物的分子量Mw。Li等[47]通過DOSY實驗測定了各種活性/受控聚合過程生產的聚合物的平均Mw。采用外標法，利用已知窄分散聚苯乙烯的logD和logMw，在3種常用受控聚合方法中準確監控聚合過程，測試結果與凝膠滲透色譜法(GPC)數據高度吻合。Stalke等提出了一種新穎的DOSY測試分子量的方法[51-53]，基于具有歸一化D的外部校準曲線(ECC)，進行分子量測定。研究人員提供了31種小分子模型，分子量Mw范圍為70～600 g/mol，可根據待分析物的分子形狀(緊湊球形、耗散球形、橢圓形、圓盤形)選擇相應的標準曲線。

內標法是向待分析物樣品中添加內部參比物，以獲得內部校準曲線(ICC)[49]。該方法需要惰性的內部參考物質，參考物質應具有理想的分子量分布，并且信號與溶液中的其他組分不重疊。李紅衛等[96]以3-(三甲基硅基)丙磺酸鈉(DSS)為內標，通過蛋白質分子與DSS 自擴散系數的比值(Dr)來表征蛋白質分子在溶液中的表觀分子量，有效地降低了儀器、樣品濃度、緩沖體系的影響。

2.4 分子間締合常數Ka

基于NMR的化學位移滴定法是確定締合常數Ka的有力工具，被廣泛用來量化多組分系統中分子間的相互作用[44]。在某些情況下，化學位移滴定法容易將酸堿化學反應與分子間的結合過程相混淆。相比之下，質子轉移對DOSY的影響微不足道，因此DOSY可以作為化學位移滴定法的有效補充[56-57]，減小由此帶來的誤差。但DOSY測量締合常數有局限性，通常只能確定10～105L/mol范圍內的Ka。1>∶1配比的主客體復合物(HG)，其主客體之間的Ka可以通過公式(3)來計算。[H]、[G]、[HG]分別是體系平衡時主體、客體、主-客體復合物的濃度：

Ka=[HG]/[H][G]

(3)

Guella等通過DOSY研究了香蘭素的自聚集以及與β-環糊精的絡合平衡[37]。香蘭素在水中的自締合常數很低(Ksa=(9.8±0.7 )L/mol)，表明其以游離和少量低聚物的形式存在。對于β-環糊精水溶液，DOSY沒有檢測到任何聚集現象。改變香蘭素/β-環糊精混合物的濃度(2～15 mmol/L)，得到的香蘭素/β-環糊精絡合常數(Ka)比香蘭素自聚集Ksa高一個數量級，從(86±7 )L/mol增加到(142±9 )L/mol，且呈現非單調變化趨勢，表明Ka實際上是一個“表觀”平衡常數。證明除了(1>∶1)香蘭素/β-環糊精絡合物之外，還存在其他締合絡合物，例如(香蘭素)2和(香蘭素/β-環糊精)2。

3 結論與展望

DOSY可以通過測量混合物的擴散系數，分離鑒別混合物組成，提供分子尺寸、分子量、分子間相互作用及聚集狀態的具體信息，已成為研究化學和生物系統中分子擴散的首選方法。隨著混合物體系復雜程度的增加，DOSY的分辨能力及靈敏度是制約未來擴大其應用范圍的關鍵所在。儀器和軟件的快速發展，例如超高磁場磁體(1.2 GHz)、高靈敏度超低溫探頭、快速2D脈沖序列的出現，將使DOSY實驗更加準確和高效。除此之外，波譜學家們也在嘗試通過增加譜圖維度、優化分離算法、添加基質調控擴散系數等手段[38]，不斷擴大DOSY的應用范圍。綜上所述，DOSY實驗未來會越來越成熟，可為研究者提供可靠、高效的混合物表征手段。