雞血藤韌皮部環數與多指標成分的相關性分析

梅余琪,魏麗芳,鄒立思,劉訓紅,陳佳麗,談夢霞,王程成,蔡芷辰,殷圣鑫,張芙蓉

(南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210023)

雞血藤(Spatholobi Caulis)為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖,收載于2015年版《中國藥典》,具有活血補血、調經止痛、舒筋活絡之功效,主要用于月經不調、痛經、經閉、風濕痹痛、麻木癱瘓和血虛萎黃等癥[1]。雞血藤是一味較為常用的傳統中藥,藥用價值高,市場需求量大,為多種中成藥的原料藥。現代研究表明,雞血藤主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、蒽醌類、有機酸類等化學成分[2-4]。其中黃酮類成分具有抗腫瘤[5-7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗貧血[10]等多種藥理活性；酚酸類成分原兒茶酸具有抗菌、抗炎作用,對心血管系統有明顯的藥理活性[11]。“辨狀論質”是根據藥材外觀性狀特征判斷其質量的優劣,是中藥材經驗鑒別的精髓,其實質是中藥材的性狀特征與內在質量具有相關性。雞血藤藥材斷面含深棕色樹脂狀物的韌皮部與木質部相間排列,呈數個偏心性半圓形環或同心性橢圓形環[12],傳統經驗對雞血藤藥材的質量評價認為韌皮部環數需3～8環,但這種“辨狀論質”的科學內涵至今仍不清楚,尚需深入探討雞血藤的韌皮部環數與內在質量的相關性。

關于雞血藤藥材的質量評價研究,目前多以單一成分或單黃酮類成分為考察指標,如兒茶素、表兒茶素等黃烷醇類成分[13-15],而關于同時測定多指標成分的研究很少，且多采用高效液相色譜法(HPLC)[16-17]。超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱串聯質譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)具有多反應監測(MRM)定量分析功能,融合了高靈敏度、高精度和高通量的優點,更適合中藥多組分復雜體系的分離與分析[18-20]。

中藥的藥效是多成分多靶點協同作用的結果,因此本實驗通過UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定雞血藤中黃烷醇、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、查耳酮、紫檀烷、花色素及酚酸類共22種指標成分,對不同韌皮部環數雞血藤共3個產區88個批次藥材進行分析,探究雞血藤韌皮部環數與指標成分含量的相關性,并結合主成分分析(PCA)對所有批次不同韌皮部環數雞血藤藥材進行綜合評價。旨在為建立雞血藤藥材多指標成分的綜合評價體系奠定基礎,為根據性狀特征評價雞血藤的藥材質量提供科學依據,亦為闡明中藥傳統經驗精髓“辨狀論質”的科學內涵提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SIL-20A XR超快速液相色譜儀、LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR自動進樣器和CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司)；AB QTRAP 5500三重四極桿線性離子阱質譜儀、電噴霧離子源及Analyst 1.6.3軟件(美國AB SCIEX 公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(百萬分之一,德國賽多利斯公司)；BSA224S型電子分析天平(萬分之一,德國賽多利斯公司)；KQ-500B超聲波清洗機(超聲功率500 W,40 kHz,昆山超聲儀器有限公司)；湘儀H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

對照品(純度均大于98%)：櫻黃素(批號lw18020202)、大豆苷(批號lw18081701)、美迪紫檀素(批號lw181025091)、染料木素(批號lw18051601)、原花青素B2(批號lw18042608)、柚皮素(批號lw18032311)、二氫槲皮素(花旗松素，批號lw18030202)、雞蛋黃素(鷹嘴豆芽素A，批號lw18010502)、染料木苷(批號lw18082201)、甘草素(批號lw18032403)、毛蕊異黃酮(批號lw18022412),購自南京良緯生物科技有限公司；表兒茶素(批號110878-200102)、蘆丁(批號100080-200707)、山柰酚(批號110861-201310)、芒柄花素(批號111703-200602),購自中國藥品生物制品檢定所；芒柄花苷(批號CHB1-71026)、沒食子兒茶素(批號CHB151105)、表沒食子兒茶素(批號CHB160513)、異甘草素(批號CHB171011),購自成都克洛瑪生物科技有限公司；大豆苷元(批號C06N6Y5504)、原兒茶酸(批號B21614),購自上海源葉生物科技有限公司；兒茶素(批號20161221),購自寶雞市辰光生物科技有限公司。甲醇、乙腈與甲酸(色譜純,德國默克公司)；甲醇(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司)；三氯甲烷(色譜純,上海凌峰化學試劑有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

雞血藤藥材樣品于2018年11月分別采自廣東高要、越南奠邊府、老撾瑯勃拉邦同一植株上不同韌皮部環數(3～10環)的藤莖,趁鮮切片并曬干,經南京中醫藥大學劉訓紅教授鑒定均為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的藤莖,表1為雞血藤樣品信息。憑證藥材于南京中醫藥大學藥學院中藥鑒定實驗室留樣。

表1 88批雞血藤的樣品信息Table 1 Sample informations of 88 batches of Spatholobi Caulis

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液分別精密稱取一定量的沒食子兒茶素、原兒茶酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、大豆苷、二氫槲皮素、染料木苷、蘆丁、芒柄花苷、甘草素、大豆苷元、毛蕊異黃酮、柚皮素、染料木素、山柰酚、異甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素、櫻黃素、雞蛋黃素對照品,置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解分別配制成0.970、1.042、0.994、0.996、1.035、1.004、1.110、0.980、1.032、0.990、0.988、1.052、1.006、1.010、1.038、1.002、1.006、1.300、1.026、1.135、0.456、1.184 mg·mL-1的對照品儲備液,經0.22 μm微孔濾膜濾過,備用。分別取適量的各對照品儲備液,加甲醇定容至5 mL配制成混合對照溶液,并逐級稀釋,得到一系列不同質量濃度的混合對照工作溶液,使用前保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 供試品溶液將樣品粉末過50目篩后精密稱定1.0 g,置于25 mL具塞錐形瓶中,加入10 mL三氯甲烷-甲醇(4>∶1,體積比)溶液,密閉,稱重,室溫下超聲(功率500 W,頻率40 kHz)60 min,放置冷卻,再次稱重,用三氯甲烷-甲醇(4>∶1)溶液補足失重,過濾,將濾液離心10 min(12 000 r/min)。取上清液,過0.22 μm微孔濾膜后稀釋10倍,備用。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件色譜柱XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.3%甲酸水(A)-甲醇(B)；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：2.0 μL。洗脫梯度：0～5 min,15%～30%B；5～10 min,30%～40%B；10～13 min,40%～45%B；13～15 min,45%B；15～18 min,45%～55%B；18～23 min,55%～65%B；23～28 min,65%～100%B；28～30 min,100%B。

1.3.2 質譜條件電噴霧離子源(ESI)；多反應監測(MRM)離子掃描模式檢測；離子化溫度(TEM)：550 ℃；霧化氣(GS1)流速：55 L·min-1；輔助氣(GS2)流速：55 L·min-1；氣簾氣(CUR)流速：40 L·min-1；噴霧電壓(IS)：正離子模式下4 500 V,負離子模式下-4 500 V；接口加熱,全程通入氮氣。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化考察了Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱(150 mm×2.1 mm,2.2 μm)、XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)、SynergiTMHydro-RP 100 ?柱(2.0 mm×100 mm,2.5 μm)3種色譜柱的分離效果,結果顯示,XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)具有更好的分離效果和檢測靈敏度,故實驗選擇XBridge?C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)作為色譜柱。進一步考察了以乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇與0.3%甲酸水-甲醇為流動相時的分離效果。結果表明,流動相采用0.3%甲酸水-甲醇時,各色譜峰峰形及分離較好。因此實驗選擇以0.3%甲酸水-甲醇為流動相。

2.1.2 質譜條件的優化考察了22種待測成分在電噴霧離子源正、負離子模式下的響應,結果表明,原兒茶酸、染料木苷和山柰酚在負離子模式下有較強的響應和更好的峰形,而其他成分與之相反,因此原兒茶酸、染料木苷和山柰酚選擇負離子模式,其他成分采用正離子模式進行檢測。各成分的保留時間和質譜條件見表2,混合對照溶液的MRM圖見圖1。

表2 22種目標物的保留時間及優化的質譜條件Table 2 Retention times and optimized MS parameters of 22 analytes

圖1 22種目標成分混合對照溶液(10 μg/mL)的MRM圖Fig.1 MRM chromatograms of 22 constituents in mixed reference solution(10 μg/mL)the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.2 供試品制備方法的優化

實驗以兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素及芒柄花素色譜峰的峰面積和峰形作為指標,對提取溶劑(30%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、90%甲醇/乙醇、三氯甲烷-甲醇(4>∶1))、藥液比(1>∶10、1>∶20、1>∶30、1>∶40)和提取時間(30、60、90 min)進行單因素考察,結果表明以三氯甲烷-甲醇(4>∶1)作為提取溶劑、藥液比為1>∶10、提取時間為60 min時,上述5種成分的色譜峰峰面積較大且峰形較好。綜上,最優制備方法為：三氯甲烷-甲醇(4>∶1)為提取溶劑,藥液比為1>∶10,提取時間為60 min。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系、檢出限與定量下限精密吸取“1.2.1”中不同質量濃度的混合對照工作溶液,按“1.3”色譜-質譜條件進樣分析,通過繪制對照品的峰面積(Y)與相應質量濃度(X,ng·mL-1)的關系曲線,得到回歸方程、相關系數和線性范圍。結果顯示，各化合物在對應質量濃度范圍內呈良好的線性關系(r≥0.999 0)。在相同的色譜條件下,分別以約3倍和10倍信噪比確定各成分的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結果顯示22種成分的LOD為0.07～7.99 ng·mL-1,LOQ為0.22～26.63 ng·mL-1(見表3)。

2.3.2 精密度、重復性與穩定性精密吸取一定質量濃度的混合對照品溶液2 μL,按本方法在1 d內重復進樣6次,分別計算各成分峰面積的相對標準偏差(RSD),作為日內精密度；取上述混合對照品溶液連續3 d每天重復進樣3次,分別計算各成分峰面積的RSD,作為日間精密度。結果表明,22種目標成分的日內RSD為0.60%～4.8%,日間RSD為0.90%～4.5%,說明儀器精密度良好(見表3)。

分別稱取同一雞血藤樣品粉末6份,按“1.2.2”方法制備供試品溶液,分別吸取2 μL進樣分析,計算得22種目標成分含量的RSD為0.70%～4.5%,表明該方法重復性良好；在不同時間間隔(0、2、4、8、12、24 h)對同一樣品進行分析,測得22種目標成分峰面積的RSD為0.50%～4.3%,表明供試品溶液在24 h內具有較好的穩定性。

2.3.3 加標回收率實驗精密稱定9份已知含量的樣品,每份約0.5 g,置于具塞錐形瓶中,分別按已知含量的80%、100%、120%加入一定量的各對照品溶液(每個水平3份),按“1.2.2”制備加標回收供試品溶液,并按上述色譜-質譜條件進樣測定后,計算各成分的平均回收率及RSD。22種目標成分的平均回收率為96.8%～103%,RSD為0.80%～4.4%,表明該方法的準確度良好(見表3)。

表3 22種目標成分的線性范圍、檢出限、定量下限、精密度及加標回收率實驗結果Table 3 Linear ranges,limits of detection,limits of quantitation,precisions and recovery experimental results of 22 compounds

(續表3)

圖2 高要、越南、老撾產區不同韌皮部環數雞血藤中22種目標成分總含量的柱狀圖Fig.2 Histogram of 22 target components in Spatholobi Caulis with different phloem ring numbers from Gaoyao,Vietnam and Laos

2.4 樣品含量測定

吸取2 μL供試品溶液注入液相色譜-質譜儀,按上述條件測定,根據線性方程分別計算供試品溶液中待測目標成分的含量。對高要、越南、老撾3個產區雞血藤中所測成分總含量進行柱狀圖分析(如圖2),結果表明不同產地之間雞血藤中各成分的總含量存在一定差異,其中高要產區的總含量整體高于越南和老撾兩產地。

3個產區不同韌皮部環數雞血藤中的原兒茶酸含量和黃酮類成分總含量見圖3。由圖3可知,3個產地雞血藤各樣品中原兒茶酸的含量均高于黃酮類成分總含量,且原兒茶酸與兩類成分總含量的變化趨勢基本一致。高要、越南、老撾三產區分別以韌皮部環數10環、8環、9環的雞血藤中指標成分含量較高。高要產區不同韌皮部環數雞血藤,指標成分總量幾乎隨韌皮部環數增加而上升；越南產區不同韌皮部環數雞血藤,3～8環的指標成分總量隨韌皮部環數增加而上升；而老撾產區不同韌皮部環數雞血藤,指標成分總量呈鋸齒形變化。整體而言,雞血藤韌皮部環數與多指標成分含量具有一定的正相關性。

圖3 不同產區不同韌皮部環數雞血藤中原兒茶酸含量和黃酮類成分總含量的動態變化圖Fig.3 Dynamic changes of protocatechuic acid and flavonoids in Spatholobi Caulis with different phloem ring numbers from different regionsA.Gaoyao，B.Vietnam，C.Laos;flavonoids,protocatechuic acid,flavonoids+protocatechuic acid

2.5 主成分分析

主成分分析根據多個變量之間的相關關系和某種線性組合進行轉化,得到少數幾個保留較多信息且之間不相關的綜合變量,其目的是構造輸入變量的少數線性組合,盡量多地解釋數據的變異性[21]。

本文采用SPSS 22.0統計軟件,將不同韌皮部環數的雞血藤藥材中22個成分的定量結果組成矩陣,數據經標準化處理后進行主成分分析。主成分分析中特征值及貢獻率結果如下：第一主成分的特征值和方差貢獻率分別為6.927和31.486%；第二主成分的特征值和方差貢獻率分別為5.711和25.957%；第三主成分的特征值和方差貢獻率分別為3.620和16.459%；第四主成分的特征值和方差貢獻率分別為1.527和6.939%；第五主成分的特征值和方差貢獻率分別為1.386和6.298%；其他主成分特征值的貢獻率依次減少。前5個主成分的累積貢獻率達87.139%,且特征值均大于1,能較客觀地反映不同韌皮部環數雞血藤藥材的綜合質量,故選取前5個主成分進行分析。

每個主成分均為原始變量的線性組合,線性組合中各變量對主成分的影響用載荷表示,載荷絕對值越大,表明其影響越大[22]。由表4可知,在第一主成分中,沒食子兒茶素、染料木苷和芒柄花苷的因子載荷量最大；第二主成分主要反映了甘草素和異甘草素的信息；在第三主成分中毛蕊異黃酮的載荷因子較大；第四主成分中蘆丁的載荷量較大,是對第四主成分影響較大的特征向量；第五主成分主要反映了櫻黃素和原兒茶酸的信息，此外，山柰酚和芒柄花素對第五主成分有較強的逆負荷。前5個主成分基本包含了大部分成分的信息。

表4 雞血藤藥材中各成分旋轉變換后的因子載荷矩陣Table 4 Rotated factor load matrix of each constituent in Spatholobi Caulis

不同雞血藤樣品的主成分各因子總得分見表5,可根據各主要因子的權重系數計算得出各樣品的綜合得分。權重系數由其方差貢獻的大小決定,各主成分的貢獻率與5個主成分的總貢獻率之比則為權重系數,如第一主成分的權重系數應為31.486%/87.139%=0.361 3,同理第二、三、四、五主成分的權重分別為0.297 9、0.188 9、0.079 6、0.072 3。各主成分因子得分與其權重系數乘積之和相加即為雞血藤樣品的總因子得分F,其表達式為F=0.361 3F1+0.297 9F2+0.188 9F3+0.079 6F4+0.072 3F5,其值越高,表明綜合質量越好。由表5可知,高要產區10環、9環的雞血藤樣品綜合得分較高,藥材整體質量優于其3～8環的藥材；越南產區7～10環的雞血藤藥材質量優于3～6環的藥材；老撾產區4環、9環、10環的雞血藤藥材質量優于其它環數的藥材。相對而言,老撾產區的所有環數的雞血藤藥材綜合排名均較靠后,藥材質量比高要和越南產區差。整體來看,以高要產區韌皮部環數10環、9環的雞血藤藥材綜合質量較好。

表5 雞血藤藥材的主成分因子及品質綜合評價Table 5 Principal component factors and comprehensive quality evaluation of Spatholobi Caulis

3 結 論

本文建立了同時測定雞血藤中多種指標成分含量的UFLC-QTRAP-MS/MS方法,并結合PCA分析評價了不同韌皮部環數的雞血藤藥材質量,考察了雞血藤韌皮部環數與指標成分含量的相關性,從而為根據性狀特征評價雞血藤的藥材質量提供了科學依據,亦為闡明中藥傳統經驗精髓“辨狀論質”的科學內涵提供了新的思路和方法。