虎杖有效成分對(duì)DN模型小鼠腎組織病理改變的影響*

王達(dá)利，孟鳳仙，商學(xué)征，王 潔，張承承，白 華，卜祥偉，張正菊，劉豫玥

（1.北京市房山區(qū)燕山地區(qū)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 102500；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3.北京市順義區(qū)中醫(yī)院，北京 101300；4.北京市西城區(qū)廣外醫(yī)院，北京 100053；5.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廈門 361005）

現(xiàn)代研究認(rèn)為糖尿病腎病（DN）是一種由于代謝紊亂等多因素引起的腎臟慢性炎性疾病[1]，已成為一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。DN晚期可出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰竭，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。本課題組認(rèn)為DN發(fā)病強(qiáng)調(diào)累及腎臟病變，腎消精液枯竭，經(jīng)絡(luò)血澀，榮衛(wèi)不行，熱氣留滯；腎虛不化，以致濕濁內(nèi)停；糖尿病久治不愈，濕、熱、瘀、濁壅滯化生內(nèi)毒，損傷腎絡(luò)。結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為腎陰虧虛，瘀毒、內(nèi)熱、濕濁互結(jié)為本病發(fā)病核心，三者既為發(fā)病因素又為病理產(chǎn)物。虎杖為草本植物，具有清熱解毒、散瘀止痛之效，取其泄“濁”之意，在控制糖尿病腎病方面有一定療效[2]。現(xiàn)代藥理研究，虎杖主要成分是大黃素、虎杖苷，該成分能夠抗炎，抗氧化，改變血流變，抑制免疫炎性反應(yīng)等作用[3]。本研究觀察虎杖有效成分大黃素、虎杖苷對(duì)DN模型小鼠腎組織病理改變的影響，探討其對(duì)腎小球、腎小管病變，腎間質(zhì)炎癥，腎小球基質(zhì)相對(duì)面積以及腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性8～9周齡自發(fā)性2型糖尿病模型 KK-Ay小鼠 90只，體質(zhì)量（30.94±1.67）g（北京華阜康實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004）。SPF級(jí)雄性8～9周齡 C57BL/6J小鼠 6 只，體質(zhì)量（24.57±1.60）g（北京華阜康實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0007）。小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK（京）2011-0024]，單籠飼養(yǎng)，室溫 18～24℃，相對(duì)濕度40%～70%。2種配方的高脂飼料，配方1：蛋白質(zhì)10%，脂肪10%，葡萄糖10%，70%全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料；配方2：豬油20%，葡萄糖6%，蛋黃粉13%，酪蛋白8%，基礎(chǔ)飼料53%（北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0008）。普通飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。虎杖苷（中國藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)111575-200502）；大黃素（中國食品藥品檢定研究所，生產(chǎn)批號(hào) 110756-200110）。纈沙坦：80 mg×7粒×1盒（北京諾華制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：SC1300）。

1.2 造模及分組 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，C57BL/6J小鼠予普通飼料喂養(yǎng)；KK-Ay小鼠給予高脂飼料配方1喂養(yǎng)3 d，配方2喂養(yǎng)3 d，普通飼料喂養(yǎng)3 d，3種飼料交替使用誘導(dǎo)3周。檢測(cè)KK-Ay小鼠隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L，24 h尿蛋白高于正常組，DN模型誘導(dǎo)成功。90只KK-Ay小鼠均造模成功，成模率100%。根據(jù)血糖及體質(zhì)量水平隨機(jī)選擇84只小鼠均分為模型組，陽性藥組，大黃素高、中、低劑量組，虎杖苷高、中、低劑量組，丙藥、丁藥高、中、低劑量組，每組6只（本實(shí)驗(yàn)不對(duì)丙藥、丁藥進(jìn)行觀察）。

1.3 干預(yù)方法 正常組及模型組予去離子水10mL/（kg·d）灌胃，陽性藥組予纈沙坦13.33mg/（kg·d）灌胃。大黃素各組分別予13.33、6.67、3.33 mg/（kg·d）大黃素灌胃；虎杖苷各組分別予13.33、6.67、3.33 mg/（kg·d）虎杖苷灌胃。根據(jù)體表面積換算，小鼠用藥等效劑量為正常人體的10倍。各組小鼠每日灌胃1次，連續(xù)干預(yù)12周。由于操作失誤，灌胃過程中大黃素低劑量組小鼠死亡1只。

1.4 腎臟組織病理學(xué)檢測(cè) 干預(yù)12周后，小鼠麻醉取血，處死，迅速摘取雙側(cè)腎臟。1/2左腎置于10%中性福爾馬林溶液固定，以備光鏡觀察及免疫檢測(cè)，取材、脫水、包埋、4 μm切片后，行蘇木精-伊紅（HE）和高碘酸希夫氏（PAS）染色。HE染色鏡下觀察腎小球、腎小管及腎間質(zhì)的病變，對(duì)上述病變進(jìn)行評(píng)分；對(duì)于PAS，每張切片在40倍物鏡下隨機(jī)選取10個(gè)正切的腎小球，測(cè)量并計(jì)算腎小球基質(zhì)相對(duì)面積，即腎小球基質(zhì)面積/腎小球面積×100%，取均值（Olympus DP71分析系統(tǒng)）。1/2左腎置于2.5%戊二醛固定，以備電鏡檢測(cè)觀察腎組織形態(tài)改變。右腎迅速置于液氮中保存。

1.5 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《腎臟病理學(xué)診斷技術(shù)》，結(jié)合本試驗(yàn)糖尿病腎病模型中腎組織病變的性質(zhì)及程度制定以下診斷標(biāo)準(zhǔn)（表1）：1個(gè)+號(hào)代表1分，計(jì)算每只動(dòng)物腎臟分類評(píng)分及總積分，總積分=腎小球病變?cè)u(píng)分+腎小管病變?cè)u(píng)分+炎性壞死評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，等級(jí)資料組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間兩兩比較采用All Pairwise法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。腎小球基質(zhì)相對(duì)面積的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 各組小鼠腎組織病理改變結(jié)果

2.1 光鏡下觀察HE染色切片 HE染色下，觀察正常組小鼠的腎小球及腎小管未見明顯病變，腎間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤，腎組織結(jié)構(gòu)正常。模型組所有小鼠的腎小球均有不同程度的增大，系膜基質(zhì)輕、中度增生，個(gè)別腎小球基底膜增厚；大部分小鼠可見少量的腎近曲小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分腎小管輕、中度擴(kuò)張，基底膜增厚；除外1只小鼠均伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主。與正常組比較，模型組小鼠腎臟腎小球、腎小管具有顯著病變，伴有炎癥細(xì)胞浸潤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽性藥組除外1只小鼠腎臟未見明顯病變，大部分小鼠腎臟均有顯著病變，與模型組比較未見顯著差異（P＞0.05）。在改善腎小球病變方面：與模型組比較，大黃素高劑量、虎杖苷高劑量組小鼠的腎小球病變有減輕趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在改善腎小管病變方面：與模型組比較，虎杖苷高劑量組小鼠腎小管病變顯著減輕（P＜0.05），大黃素各劑量組、虎杖苷低劑量組小鼠腎小管病變有減輕趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在減輕腎間質(zhì)炎癥方面：與模型組比較，虎杖苷低劑量組小鼠腎間質(zhì)炎癥有減輕趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組腎間質(zhì)炎癥與模型組相比未見明顯差異。

綜合考慮腎臟病變情況，比較各組小鼠腎臟病變總積分。與正常組比較，模型組小鼠腎臟病變總積分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組，大黃素各劑量組，虎杖苷高、低劑量組小鼠腎臟病變總積分具有減輕趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2，圖1。

表1 DN模型小鼠腎臟病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組小鼠腎臟病變總積分比較

圖1 各組小鼠腎臟組織變化情況（HE，400×）

2.2 腎小球基質(zhì)相對(duì)面積 PAS染色下，測(cè)量并計(jì)算腎小球基質(zhì)相對(duì)面積。正常組小鼠光鏡下可見腎小球結(jié)構(gòu)正常，系膜基質(zhì)未見增生。與正常組比較，模型組小鼠腎小球系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，模型組小鼠腎小球基質(zhì)相對(duì)面積顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。光鏡下觀察可見陽性藥組，大黃素各劑量組，虎杖苷中劑量組小鼠腎小球系膜基質(zhì)可見不同程度的增生。與模型組比較，大黃素高劑量組，虎杖苷各劑量組小鼠腎小球基質(zhì)相對(duì)面積顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。詳見表 3，圖 2。

2.3 電鏡檢查 電鏡能夠觀察到光鏡下不能分辨的超微病理改變和特殊結(jié)構(gòu)。足細(xì)胞受損是DN發(fā)生發(fā)展的核心事件[4]，本研究采用電鏡檢測(cè)小鼠腎組織足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。正常組小鼠腎組織基底膜正常，組織緊密。模型組小鼠腎組織可見基底膜增厚，足突倒伏、融合，腎間質(zhì)纖維化，符合DN病理表現(xiàn)。與模型組比較，陽性藥組小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)病變較輕，基底膜薄厚較均一，足突形狀欠整齊，部分足突倒伏、融合，腎小球未見纖維化改變；大黃素高劑量組小鼠腎組織部分基底膜增厚，足突倒伏、融合；大黃素中劑量組基底膜欠均一，足突倒伏、融合；大黃素低劑量組部分基底膜增厚，部分足突倒伏、融合；大黃素各劑量組腎小球均未見固化或纖維化。虎杖苷高劑量組小鼠腎小球損傷較嚴(yán)重，腎小球固化，可見纖維化；虎杖苷中劑量組基底膜較均質(zhì)，足突基本正常，少量倒伏、融合；虎杖苷低劑量組基底膜欠均一，大量足突倒伏、融合。虎杖苷各劑量組中，虎杖苷中劑量組明顯改善小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)病變。

表3 各組小鼠腎小球基質(zhì)相對(duì)面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）

表3 各組小鼠腎小球基質(zhì)相對(duì)面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）

注：與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 腎小球基質(zhì)相對(duì)面積（%）對(duì)照組 6 0.115±0.044模型組 6 0.197±0.062**陽性藥組 6 0.185±0.050大黃素高劑量組 6 0.159±0.058#大黃素中劑量組 6 0.184±0.053大黃素低劑量組 5 0.167±0.045虎杖苷高劑量組 6 0.112±0.057##虎杖苷中劑量組 6 0.135±0.068##虎杖苷低劑量組 6 0.102±0.068##

圖2 各組小鼠腎小球系膜增生情況（PAS，400×）

圖3 各組小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)（電鏡，15000×）

3 討論

目前廣泛接受高血糖是導(dǎo)致DN的核心環(huán)節(jié)[5]，而氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子相互作用、自噬行為、遺傳等因素，加速了DN發(fā)生發(fā)展[6]。越來越多的研究證明，炎癥反應(yīng)在DN發(fā)病機(jī)制中的重要作用[1]。

虎杖及其有效成分在抗病毒、抗氧化、抗血栓、改善微循環(huán)、消炎鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)代謝方面的藥理作用成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)之一[7]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其主要的活性成分為大黃素及白藜蘆醇（虎杖苷），兩者在抑制DN損傷中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道指出，虎杖苷通過抑制了DN的氧化損傷，保護(hù)近球腎小管Na+，K+-ATPase活性，進(jìn)而使腎功能免受高糖環(huán)境介導(dǎo)的損害[8]。虎杖苷可以通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號(hào)通路，下調(diào)炎癥因子表達(dá)水平，改善DN大鼠腎臟的炎性損傷[9]。而大黃素作為虎杖的另一主要成分，在治療DN損傷中具有重要意義。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠抑制DN患者外周血中單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）表達(dá)水平，降低尿蛋白、改善腎功能。為了進(jìn)一步明確虎杖的兩種有效成分對(duì)DN腎臟損傷的改善作用，本實(shí)驗(yàn)選用KK-Ay小鼠予高脂飼料誘導(dǎo)3周制備小鼠DN模型，分組后藥物干預(yù)12周，通過HE、PAS染色后光鏡下觀察，模型組小鼠腎臟病理改變符合DN，各給藥組對(duì)DN模型小鼠腎病理損傷有不同程度的改善作用，其中經(jīng)虎杖苷高劑量干預(yù)后可顯著減輕模型動(dòng)物腎小管病變，減緩近曲小管空泡變性、擴(kuò)張，基底膜增厚病理狀態(tài)；大黃素高劑量，虎杖苷各劑干預(yù)顯著降低腎小球基質(zhì)相對(duì)面積，有效減輕腎小球系膜基質(zhì)增生，抑制腎小球硬化及腎組織纖維化。從病理學(xué)角度觀察虎杖有效成分對(duì)減輕腎間質(zhì)炎性浸潤不明顯，需通過對(duì)其炎性細(xì)胞因子的影響做進(jìn)一步的研究。

足細(xì)胞損傷包括足細(xì)胞數(shù)量減少及足突的增寬倒伏、融合消失，與蛋白尿的產(chǎn)生和腎小球硬化的發(fā)生關(guān)系密切。因此減輕DN腎組織足細(xì)胞足突融合、消失，可以減輕足細(xì)胞損傷，對(duì)DN模型小鼠的腎臟具有一定保護(hù)作用。本次研究結(jié)果顯示，大黃素可改善DN模型小鼠腎小球病變，腎小球均未見固化或纖維化。虎杖苷高劑量組腎小球損傷較嚴(yán)重，可能與虎杖苷高劑量藥物毒性有關(guān)。虎杖苷中劑量可明顯改善DN模型小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)病變，足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)基本正常。虎杖苷中劑量可改善足細(xì)胞足突倒伏、融合情況，對(duì)探討虎杖苷改善腎小球硬化，減少尿蛋白具有重要意義。本文檢測(cè)了虎杖有效成分大黃素、虎杖苷對(duì)改善DN模型小鼠腎臟病理損傷的作用，為研究單味中藥發(fā)揮臨床作用機(jī)制提供證據(jù)，其腎臟保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制有待更深層次的探索。

由此可見，虎杖有效成分大黃素、虎杖苷可不同程度減輕DN模型小鼠腎組織病理損傷，改善腎小管病變；延緩腎小球細(xì)胞外基質(zhì)增生，改善腎小球病變，抑制腎小球硬化及腎組織纖維化，對(duì)其腎臟病變具有保護(hù)作用。但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。