丹參川芎嗪注射液改善缺血性卒中大鼠Th17/Treg平衡減輕神經缺血損傷的研究*

全宏娟

（湖南省郴州市第一人民醫院神內重癥科，郴州 423000）

腦缺血誘發的中樞免疫炎癥反應是卒中重要的病理特征之一。研究顯示，T淋巴細胞是腦內持續炎癥反應發生的核心[1]。腦缺血后，外周淋巴細胞等免疫細胞受趨化因子募集，穿過損傷的血腦屏障浸潤至腦組織，引起腦內的特異性免疫應答；并和腦內固有的免疫細胞如小膠質細胞一起產生更多的炎性介質，惡化神經缺血損傷[2]。Th17與Treg細胞為功能相反的CD4+T淋巴細胞亞群，Th17促進炎癥反應，而Treg抑制炎癥反應，二者數量與功能的平衡是維持自身免疫穩態的關鍵因素[3]。已有一些證據提示Th17和Treg參與了缺血后的腦內免疫炎癥反應過程[4-6]，那些具有抑制Th17而增強Treg細胞數量及功能的治療策略，則有助于炎癥環境下神經細胞的保護。

丹參川芎嗪注射液（DCZ）是臨床治療缺血性卒中的常用藥，主要成分為丹參素與鹽酸川芎嗪，二者協同起效，具有降低血黏度、擴張腦局部血管，改善腦組織改善微循環、減輕腦組織水腫、抑制神經細胞凋亡的作用[7]。目前對丹參川芎嗪注射液對卒中后腦內免疫炎癥反應的調節作用關注甚少，且多集中于對炎癥因子水平的改善。因此，本研究擬觀察丹參川芎嗪注射液對卒中后大鼠腦內Th17/Treg的影響，以闡明Th17/Treg在卒中后的變化規律，為臨床使用丹參川芎嗪注射液治療卒中提供更多實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 紅細胞裂紅液、Percoll細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI Medium 1640培養液購自上海立菲生物技術有限公司；APC Mouse Anti-Rat CD3、FITC Mouse Anti-Rat CD4、PE Mouse Anti-RatCD25、PE MouseAnti-RatCD8a、Transcription Factor Buffer Set、4 ×Fix/Perm Buffer、Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug購自美國 BD 公司；APC Foxp3、Anti-Rat IL-17A APC 購自美國 eBio science；IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10 的ELISA試劑盒購自德國IBL公司。

1.1.2 主要儀器 臺式高速離心機為德國Eppendorf公司（Centrifuge 5430 R）；流式細胞儀為美國BD公司（FACS Calibur）；多功能酶標儀為美國Molecular Devices公司（SpectraMax i3）。

1.2 動物分組、造模 動物分組：健康雄性Wistar大鼠，體質量190～210 g，適應性喂養一周。將大鼠隨機分為假手術組和大腦中動脈阻塞（MCAO）組。除假手術組為10只動物，MCAO組在手術后根據神經功能缺損評分（NSS評分）剔除NSS＜2分的大鼠，剩余大鼠隨機分為模型組和參芎組，每組有24 h、3 d、7 d、14 d 共 4 個時相，每時相各 10 只動物。

造模方法：采用Zea Longa腔內線栓法阻滯大鼠右側大腦中動脈，制作MCAO模型。尼龍線直徑為0.205mm。見參考文獻（Longa ZE.Stroke，1989，20（1）：84-91）。假手術組僅鈍性分離血管但不結扎，亦不插線，余處理同MCAO組。

1.3 給藥方法 根據Meeh-rubner體表面積公式及相關文獻計算大鼠用藥量[8]：大鼠劑量（mL）=成人日劑量（10 mL）×0.018/0.2 kg=0.9 mL/kg。參芎組于造模后按體質量腹腔注射0.9 mL/kg的丹參川芎嗪注射液，每日1次；假手術組和模型組給予等量生理鹽水。

1.4 實驗方法

1.4.1 神經功能缺損檢測 根據NSS評分標準，對各組動物的神經功能進行評分[9]。NSS評分是一種針對運動、感覺、反射和平衡功能的綜合性評價指標，分值為0～18分，分值越高表示損傷程度越重。

1.4.2 TTC染色法檢測梗死體積百分比 各組大鼠麻醉后采用0.01M PBS和4%多聚甲醛常規方法經心灌注固定；取腦，-20℃冰凍腦組織20 min后，行冠狀連續切片，片厚2 mm，共切6片。將切片置于2%的TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液中，37℃避光孵育20 min，后用4%多聚甲醛固定24 h。拍照，以Image Pro-plus 6.0軟件計算腦片總面積及梗死面積，將面積之和乘以厚度（2 mm），得出腦片總體積和梗死體積，由此計算出梗死體積百分比。

1.4.3 流式細胞術分析Th17、Treg細胞的比例 治療結束后，將大鼠麻醉，分離大腦中動脈供血區的腦組織。將腦組織置于RMPI 1640培養液中，300目不銹鋼篩網上機械法制成單細胞懸液。懸液中依次加入3 mL 37%和70%的Percoll溶液，500×g離心20 min，分離中間層（單個核細胞層），洗滌并重懸細胞。

Treg細胞抗體標記：取腦單細胞懸液，加入2倍體積的紅細胞裂解液，4°C孵育15 min，450×g離心10 min，1×PBS 洗滌并重懸細胞。加入 1.5 μL CD4和 2.5 μL CD25，4℃避光孵育 20 min。1×PBS 洗滌并重懸細胞。渦旋加入 1 ml 1×Fix/Perm Working Solution破膜，4℃避光孵育 40 min，1× Perm/Wash洗滌并重懸細胞。加入2.5 μL FoxP3抗體，4℃避光孵育50 min。1×Perm/Wash洗滌并重懸細胞。加入500 μL 1×PBS溶液重懸細胞，過300目篩，流式細胞儀檢測。

Th17細胞抗體標記：取200 μL腦單細胞懸液，加入 4 μL 刺激液、200 μL RMPI 1640 培養液，37 ℃孵育 4 h。加入各 5 μL CD8a、CD3、CD4 抗體，室溫避光孵育20 min。加入2倍體積的紅細胞裂解液，4℃孵育 15 min，450×g離心 10 min。加 5 μL IL-17A抗體，4℃避光孵育40 min。1×PBS溶液洗滌并重懸細胞，過300目篩，流式細胞儀檢測。

所有樣本經流式細胞儀檢測，并分析樣品中Th17和Treg細胞的比例。陰性對照不加一抗，以相應的同型對照抗體替代。

設門方案：根據淋巴細胞物理性質，以前向角、側向角參數設立淋巴細胞門，根據淋巴細胞生物學特性，利用細胞表面抗原熒光染色表達情況設立CD3+T淋巴細胞門，再在CD3+T淋巴細胞中設立CD4+T淋巴細胞門，在CD4+T淋巴細胞門下設CD25+Foxp3+Treg細胞門或CD4+IL17a+Th17細胞門。

1.4.4 ELISA法檢測炎性細胞因子水平 依照試劑盒說明書，檢測組織中Th17相關細胞因子（IL-6、TNF-α）；Treg相關細胞因子（IL-4、IL-10）。

2 數據統計

采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。結果以均數±標準差（±SD）表示；組間比較采用單因素方差分析；組間多重比較采用LSD法（方差齊）/Dunnett’s T3法（方差不齊）；重復測量數據采用雙因素方差分析，以分組作為組間因素，不同時間點作為組內因素。顯著性差異水平α=0.05，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

3 結果

3.1 對MCAO大鼠NSS評分的影響 造模前，所有實驗大鼠的NSS評分均為0；假手術組各時間點的NSS評分也為0。模型組24 h的NSS評分最高，其后的時間點逐漸降低，組內比較差異顯著（P＜0.01）。參芎組各時間點NSS評分也呈逐漸降低趨勢，組內比較差異顯著（P＜0.01）；從第3天開始，與同時間點模型組 NSS 評分差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），見表 1。

表1 各組大鼠NSS評分結果比較（±SD）

表1 各組大鼠NSS評分結果比較（±SD）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 24 h 3 d 7 d 14 d假手術組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 9.30±1.77**8.10±1.66**6.80±1.41**4.90±1.29**參芎組 10 8.10±1.61 6.90±1.48# 4.90±1.32# 2.80±0.58##

3.2 對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 模型組24h的腦梗死體積最大，其后的時間點梗死體積逐漸降低，組內比較差異顯著（P＜0.01）。參芎組各時間點梗死體積也逐漸降低，組內比較差異顯著（P＜0.01）；且從24 h開始，較同時間點模型組梗死體積明顯縮小，組間比較差異顯著（P＜0.01），見表 2。

3.3 對MCAO大鼠腦內Th17、Treg細胞比例的影響 模型組腦內Th17細胞比例在造模后逐漸升高，于第7 d達到峰值，而后下降，但至14 d時仍高假手術組；第3、7、14 d的比例均高于假手術組，組間比較差異顯著（P＜0.01）。模型組腦內Treg細胞比例在造模后24 h和3 d較假手術組有所降低，但組間比較無顯著差異；至7 d時，模型組Treg細胞比例大量增加，與假手術組相比差異顯著（P＜0.01），見表3，圖 1。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（%,±SD）

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（%,±SD）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 24 h 3 d 7 d 14 d假手術組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 26.82±3.09**25.36±3.84**23.90±3.53**20.89±4.62**參芎組 10 24.74±3.64# 19.14±4.77##16.52±3.90##13.23±3.05##

與模型組相比，參芎組能降低各時間點Th17細胞比例，且第3、7、14 d的降低幅度較大，與模型組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；同時，參芎組能提高不同時間點Treg細胞比例，且第7 d和14 d尤為明顯，與模型組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），見表 3，圖 2。

從Th17/Treg比值來看，模型組各時間點Th17/Treg比值均顯著高于假手術組（P＜0.05，P＜0.01）；而參芎組能降低Th17/Treg比值，與模型組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）見表 3。

3.4 對MCAO大鼠腦內炎性細胞因子水平的影響 模型組腦內IL-6和TNF-α水平在造模后逐漸升高，于第7 d達到峰值，而后下降，但至14 d時又高于假手術組；且各時間點的水平均高于假手術組，組間比較差異顯著（P＜0.01）。模型組腦內IL-4和IL-10水平在造模后較假手術組有所降低，且IL-4降低更為明顯（P＜0.05）；但各時間點間差異并不顯著。與模型組相比，參芎組能降低各時間點IL-6和TNF-α水平，組間比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；同時參芎組腦內IL-4和IL-10水平也有所升高，特別是IL-4升高更為明顯（P＜0.05），見表4。

表3 各組大鼠腦內Th17、Treg細胞的比例（±SD）

表3 各組大鼠腦內Th17、Treg細胞的比例（±SD）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

指標24 h 3 d 7 d 14 d組別n假手術組模型組參芎組假手術組模型組參芎組假手術組模型組參芎組Th17（%）Treg（%）Th17/Treg 10 0.75±0.24 0.80±0.26 0.69±0.21 0.69±0.23 10 1.03±0.42 2.15±0.86** 4.75±1.44** 3.42±1.45**10 0.84±0.26 1.63±0.52# 3.27±0.95## 2.10±0.71##10 0.32±0.11 0.32±0.10 0.30±0.14 0.32±0.15 10 0.29±0.084 0.31±0.10 0.48±0.14** 0.51±0.23**10 0.34±0.13 0.40±0.12 0.62±0.18# 0.71±0.25##10 2.31±0.60 2.51±0.59 2.31±0.61 2.16±0.52 10 3.52±1.15* 6.93±1.26** 9.88±2.31** 6.68±2.24**10 2.45±0.63 4.08±1.18# 5.24±1.25## 2.97±1.13##

圖1 腦內Th17細胞比例

4 討論

在缺血性腦卒中的發生發展過程中，免疫炎癥反應作為導致神經元凋亡、壞死的重要原因而貫穿該過程始終。作為細胞免疫應答的主體，T淋巴細胞是腦內持續炎癥反應發生的核心，而各CD4+T淋巴細胞亞群則在缺血性腦卒中發病的免疫學機制中發揮著重要作用[1]。

圖2 腦內Treg細胞比例

Th17與Treg細胞是起源相同、功能相反的CD4+T細胞亞群。Th17細胞能促進炎癥反應，通過分泌IL-17、IL-6、TNFα等炎癥因子在炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用[10]。IL-17能誘導IL-6、TNF-α、趨化因子和MMPs等炎癥因子釋放，引起組織浸潤和破壞；還能促進樹突狀細胞成熟和趨化、刺激T細胞活化[11]。IL-6、TNF-α等炎癥因子不僅誘導中性粒細胞的募集和趨化；還能進一步促進Th17分化并表達IL-17，進而加重炎癥反應。Treg細胞通過分泌細胞因子IL-10、TGF-β、IL-4等抑制炎癥反應，通過控制免疫應答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩態，Foxp3是其表面特異性標志物[12]。Treg不僅直接抑制效應T細胞的活化增殖，還能與效應T細胞競爭性結合IL-2，從而誘導效應T細胞凋亡[13]。Treg還能促進TGF-β等抗炎因子分泌來抑制效應T細胞的活性。此外，Treg還能抑制樹突狀細胞和NK細胞的功能；進而抑制效應T細胞的活化；Treg還能抑制中性粒細胞表達MMP9，從而減少組織損傷[14]。

表4 各組大鼠腦內炎癥因子水平（±s）

表4 各組大鼠腦內炎癥因子水平（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

指標（pg/g）IL-6 24 h 3 d 7 d 14 d 10 289.13±25.56 293.49±39.21 283.76±31.40 301.44±29.79 10 413.28±27.32** 619.40±75.96** 715.71±65.61** 577.20±48.02**10 352.16±31.88# 444.55±62.71## 475.49±33.51## 343.17±34.16##10 62.24±11.71 63.32±11.09 61.19±12.78 65.71± 9.18 10 88.37±14.23* 115.35±12.17** 148.57±15.72** 105.96±13.80**10 75.28± 9.22# 94.23±10.57## 105.82±13.59## 74.81±12.47##10 401.18±38.27 407.65±34.05 405.82±18.59 413.15±27.70 10 366.61±29.23* 341.48±25.84* 331.86±27.56* 352.95±23.23*10 410.26±22.50# 399.96±40.67# 404.48±24.26# 422.75±31.62#10 414.10±38.27 407.15±21.72 422.22±27.19 411.15±23.19 10 401.59±21.81 384.13±25.33 386.65±32.25 393.70±27.56 10 419.91±35.46 417.20±11.92 427.32±29.78 416.56±31.82組別假手術組模型組參芎組假手術組模型組參芎組假手術組模型組參芎組假手術組模型組參芎組n TNF-α IL-4 IL-10

研究顯示，Th17和Treg通過細胞因子間的相互作用、轉化等參與急性缺血性腦卒中的發生和發展。MCAO小鼠缺血后72 h，可見腦內Th17細胞數量顯著增加，其相關促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α表達顯著上升；而Treg細胞數量及相關細胞因子IL-10未見明顯變化[4]。缺血腦組織表達IL-17增多；削弱IL-17的功能后，腦缺血面積縮小[5]。腦缺血后，腦內Treg數量明顯增多，腦內Treg數量與缺血面積呈負相關；增強Treg功能可減輕腦內免疫炎癥反應、抑制小膠質細胞活化；并使缺血面積減小、神經功能改善；而去除Treg則阻礙神經功能恢復[15]。靜脈輸注體外擴增的Treg細胞，可改善腦缺血大鼠神經炎癥反應[6]。采用低劑量抗原誘導缺血前免疫耐受，可導致Treg功能增強，分泌抗炎因子TGF-β和IL-10增多，從而減輕神經缺血損傷[16]。

丹參川芎嗪注射液（DCZ）為丹參素與鹽酸川芎嗪的復方中藥注射液。丹參素在中藥丹參中含量較高，其水溶性好，易于吸收，能快速透過血腦屏障[17]。丹參素可呈劑量依賴性地抑制血小板聚集，且對凝血酶原時間、纖維蛋白原等凝血四項指標無影響，提示丹參素在溶栓方面具有良好的安全性[18]。丹參素還能通過抑制缺血性卒中腦內凋亡基因Bax、caspase-3等表達、降低NF-κB通路活性、降低IL-1β、IL-6和 TNF-α 等炎癥因子水平[19]、減少細胞內乳酸脫氫酶水平、降低氧化損傷等，改善半暗帶腦區缺血、缺氧及炎癥反應水平，來減少神經元存活微環境，進而改善神經功能[20]。川芎嗪為中藥川芎的主要活性物質，屬生物堿類。川芎嗪是鈣拮抗劑，通過抑制Ca2+內流并促進胞內Ca2+釋放、提高內皮型一氧化氮合酶磷酸化水平、提高線粒體生物合成而促進有氧代謝，進而保護血管內皮細胞的功能、促進血管舒張[21]。川芎嗪可減少MCAO大鼠腦梗死面積、促進神經功能恢復、促進神經發生和軸突形成；還可促進體外培養的皮層神經元分化[22]。川芎嗪可降低血腦屏障通透性、抑制MCAO大鼠腦內中性粒細胞活化[23]、抑制NF-κB通路激活及炎癥因子表達、激活Nrf2/HO-1通路以減輕缺血引起的氧化損傷、抑制神經元型一氧化氮合酶表達等發揮神經保護作用[24]。臨床研究顯示，丹參川芎嗪注射液能顯著改善卒中患者神經缺損癥狀，并可改善患者血脂、降低血清同型半胱氨酸和高敏C反應蛋白水平、提高超氧化物歧化酶活性等[25-26]。

本研究結果顯示，MCAO大鼠腦缺血后NSS評分明顯增高，腦梗死體積較大。丹參川芎嗪注射液能明顯改善其NSS評分，降低梗死體積。MCAO大鼠腦內神經炎癥反應快速激活，在缺血后24 h就可見Th17細胞比例及其相關細胞因子IL-6和TNF-α水平增加；且隨缺血時間延長而進一步增長。Th17細胞比例的這種變化也與NSS評分改變相一致。至缺血后3 d，Treg細胞比例較假手術組降低，直至缺血后7 d，Treg細胞比例方有所上升。而Treg相關細胞因子IL-4和IL-10水平在缺血后7 d仍低于假手術組，至缺血后14 d，二者水平方有所上升。丹參川芎嗪注射液能降低Th17細胞比例及IL-6和TNF-α水平；而增加Treg細胞比例及IL-4和IL-10水平。Th17/Treg比值能較好反映機體炎癥水平，本研究發現模型組Th17/Treg比值隨時間逐漸升高，至缺血后7 d達到峰值，而丹參川芎嗪注射液能明顯降低Th17/Treg比值，提示丹參川芎嗪注射液可改善Th17/Treg間的平衡，抑制腦內神經炎癥反應。

綜上，腦缺血可快速激活MCAO大鼠腦內的神經炎癥反應，表現為Th17/Treg比例失衡，促炎因子IL-6和TNF-α水平增加，而抗炎因子IL-4和IL-10水平下降。丹參川芎嗪注射液能調節缺血性卒中大鼠Th17/Treg平衡及相關炎癥因子水平，進而改善神經元存活微環境，減輕神經缺血損傷。