祛痘抗衰納米乳凝膠的制備及其對兔耳痤瘡模型的療效觀察*

王麗峰，王 強，國大亮，何 新，王 艷

（天津中醫藥大學，天津 301617）

痤瘡又稱為粉刺、青春痘，是由多種因素引起的毛囊、皮脂腺慢性炎癥性疾病。痤瘡發病時皮膚上皮細胞受損，被破壞的毛囊口分泌出大量中性粒細胞和淋巴細胞，從而在局部產生炎癥反應[1]。皮膚中的琉基數量減少，不能抑制住酪氨酸酶，使酪氨酸酶的活性增加，促使生成更多的黑色素，遺留下暫時性或永久性的色素沉著，導致容貌損毀，從而對患者的心理構成重大的負面影響[2-3]。因此在治療痤瘡時應將抗炎藥與酪氨酸酶抑制劑合用，以達到消炎與降低色素沉著的目的。

秦皮甲素（Esculin）屬于中藥化學中香豆素類成分，具有抗病原微生物的作用，對金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、綠膿桿菌都有抑制作用[4]。光甘草定（Glabridin）是光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）中的黃酮類成分之一，能夠抑制黑色素的生成，具有美白的作用[5]；能夠明顯抑制體內新陳代謝過程中所產生的自由基、從而可以防治細胞衰老。白藜蘆醇（Resveratrol）屬于多酚化合物，能通過抑制細胞內酪氨酸酶的活性，顯著降低細胞內黑色素的含量，起到美白的作用[6]。前期研究發現當白藜蘆醇與光甘草定的配比為2∶8時，有協同抑制酪氨酸酶的作用。3種藥效成分聯合使用能達到治療痤瘡，延緩衰老的目的。然而秦皮甲素、光甘草定與白藜蘆醇水溶性均較差，且白藜蘆醇化學性質不穩定，易被氧化分解[7]，這些性質使該類藥物在直接經皮給藥時吸收效果差，并且在使用過程中容易分解。納米乳是由水相、油相、表面活性劑及助表面活性劑按照合適的比例所形成的熱力學穩定的膠體分散體系[8]。納米乳載藥系統不僅能夠增加藥物的溶解性，而且也可以同時包容不同脂溶性藥物，提高一些藥物的穩定性。由于納米乳制劑既是親油性物質又是親水性物質，與角質層脂質雙分子層有很好的相容性，這種特性有助于促進藥物穿透角質層，大大提高藥物的透皮速率[9]。因此，本實驗將秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇組分配伍制成了納米乳凝膠，外用涂抹于皮膚上治療痤瘡，同時改善由痤瘡引起的粗糙老化與色素沉著。

1 材料

1.1 動物 健康成年雄性新西蘭大白兔共24只，質量為（2±0.2）kg，由中國醫學科學院實驗動物中心提供SCXK（津）20160001。

1.2 藥品及試劑 秦皮甲素對照品（中國藥品生物制品檢定所110740-201604），光甘草定對照品（純度≥98%，天津一方科技有限公司Az7lG001），白藜蘆醇對照品（中國藥品生物制品檢定所111535-201602），甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司160810），乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司160921），三乙酸甘油酯（陜西省醫藥公司20160909），1.2-丙二醇（天津市科密歐化學試劑有限公司20160317），葡聚糖凝膠G-25（北京索萊寶科技有限公司），吐溫-80（天津基準化學試劑供銷公司20160508），卡波姆940（天津泰士康制藥科技有限公司20150903），三乙醇胺（天津浩元精細化工股份有限公司20160809），甘油（天津市科密歐化學試劑有限公司20150706），油酸（天津市科密歐化學試劑有限公司20160104），光甘草定（純度≥85%，南京普怡生物科技有限公司20160902），白藜蘆醇 （純度≥85%，西安小草植物科技有限公司20160704），秦皮甲素（純度≥90%，武漢尹和化工有限公司20150503）。

1.3 儀器 高效液相色譜儀LC-2030C（日本島津），納米顆粒分析儀（HORIBA），十萬分之一分析天平EX225DZH（奧豪斯儀器有限公司），透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20 S-TWIN FEI），磁力攪拌器SP88857106（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），蠕動泵BT100-2J（保定蘭格恒流泵有限公司），萬分之一天平（上海精密科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇的含量測定

2.1.1 色譜條件 秦皮甲素的色譜條件 流動相甲醇-水（20∶80），流速為 1mL/min，檢測波長為 336 nm，Hypersil ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 25℃，進樣量為 10 μL。

光甘草定的色譜條件 流動相乙腈-水-冰乙酸（55∶44∶1），流速為 1 mL/min，檢測波長為 280 nm，Hypersil ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 30℃，進樣量為 10 μL。

白藜蘆醇色譜條件 流動相甲醇-水（45∶55），流速 1 mL/min，波長 306 nm，Hypersil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫 25 ℃；進樣量 5 μL。

2.1.2 標準曲線的建立 建立秦皮甲素標準曲線[10]。精密稱取秦皮甲素對照品10 mg，用甲醇完全溶解，定容到100 mL容量瓶中，得濃度為100 mg/L的母液，用甲醇稀釋成質量濃度分別為80、40、20、10 mg/L的對照品溶液，使用0.45μm的微孔濾膜過濾，按“2.1.1”項下進行色譜分析。利用Excel 2007對秦皮甲素的濃度與相應的峰面積作回歸曲線，并得出相應的回歸方程為 Y=700 000 0X+130 5.6（r=0.999 7），表明秦皮甲素在10～100 mg/L線性關系良好。

建立光甘草定標準曲線[11]精密稱取光甘草定對照品2.25 mg，置于25 mL容量瓶中，以甲醇定容，制得濃度為90 mg/L的對照品儲備液。將對照品儲備液稀釋，得到一系列濃度為90、45、30、20、10、5 mg/L 的光甘草定溶液，按“2.1.1”項下進行色譜分析。利用Excel 2007對光甘草定的濃度與相應的峰面積作回歸曲線，并得出相應的回歸方程為Y=227 46X-104 9.3（r=1），表明光甘草定在 5～90 mg/L線性關系良好。

建立白藜蘆醇標準曲線[12]。精密稱取白藜蘆醇對照品6.28mg于10mL棕色量瓶內，用甲醇定容，得母液，備用。精密量取該母液適量，用甲醇稀釋成質量濃度分別為 10、20、50、100、300 mg/L 的對照品溶液，各對照品溶液與母液（6.28 mg定容至10 mL）經0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項下進行色譜分析。利用Excel2007對白藜蘆醇的濃度與相應的峰面積作回歸曲線，并得出相應的回歸方程為Y=72565X+496 5.6（R2=1），表明白藜蘆醇在 10～628 mg/L 線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗 精密量取秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇各母液分別連續進樣6次，結果峰面積的RSD分別為0.46%、0.68%、0.57%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 精密稱量秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇對照品適量于棕色量瓶內，用甲醇定容，在常溫光照下，每隔1 h測定峰面積，結果峰面積在8 h內的RSD分別為0.75%、0.63%、0.54%，表明對照品溶液在8 h內穩定。

2.1.5 加樣回收率試驗 量取9份已知質量濃度的同一批納米乳2 mL于5 mL量瓶內，分別精密加入適量的秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇對照品溶液，用甲醇定容，超聲30 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μL，測定秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇含量，計算平均回收率分別為98.53%、96.98%、97.45%，RSD分別為1.95%、1.32%、2.85%，表明該方法穩定可靠。

2.2 納米乳的制備及表征

2.2.1 納米乳的制備 將1.285 g秦皮甲素加到17.33g三乙酸甘油酯中，超聲溶解，加入0.649 5 g光甘草定，然后加入6.413 g 1.2-丙二醇，超聲溶解，加12.82 g吐溫-80，然后加0.160 8 g白藜蘆醇，超聲15 min溶解。最后加入蒸餾水，邊滴加邊攪拌，保持滴加速度為1 mL/min，攪拌速度為300 r/min，攪拌過程中，觀察溶液由透明變渾濁再變澄清，最后即得淡黃色透亮納米乳[6]。

2.2.2 納米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇的含量測定 將“2.2.1”項下制備的納米乳用甲醇稀釋適當倍數后，按“2.1.1”項下進行色譜分析，測定秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇在納米乳中的含量。

2.2.3 納米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇包封率的測定 取2.5 mL一次性注射器，將玻璃棉放置在注射器底部，加葡聚糖凝膠，2 000 r/min，離心3 min，加純化水離心，重復3次，精密移取100 μL納米乳，置于微柱中，2 000 r/min，離心3 min，加純化水，2 000 r/min，離心3 min，離心2次。取離心液置于容量瓶中，加甲醇定容至5 mL，50 W，超聲15 min，過 0.45 μm 有機濾膜，HPLC 測定其含量[13]。按以上方法平行操作3次，并依照以下公式計算藥物的包封率。

2.2.4 納米乳粒徑、電位的測定 取適量納米乳稀釋，室溫下，借助納米顆粒分析儀測定納米乳的平均粒徑和Zeta電位。

2.2.5 納米乳形態的觀察 把納米乳稀釋后滴加在覆有支持膜的銅網上，靜置5 min后用濾紙吸干，再滴加2%磷鎢酸負染3 min，烤燈烘干后，透射電鏡觀察其形態[14]。

2.2.6 納米乳凝膠的制備 卡波姆溶脹后，加入甘油、尼泊金乙酯，待攪拌均勻后加入三乙醇胺調節pH至中性，加入上述制得的納米乳繼續攪拌，即得乳白色納米乳凝膠。同法制備不含藥的空白納米乳凝膠。

2.3 納米乳凝膠對兔耳痤瘡模型的療效觀察

2.3.1 造模 新西蘭大白兔24只，分別在兔左、右外耳道內側耳導管開口處約2.5 cm×2.5 cm范圍內涂抹油酸0.3 mL，1次/d，連續13 d，建立動物痤瘡模型[15]。

2.3.2 模型評價 造模第13 d隨機取空白組與模型組動物8只，在左耳標記處取約1.5 cm×1.5 cm作皮膚活檢，組織塊以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，每個標本作連續切片3張，HE染色，在顯微鏡下觀察，評價造模情況。

2.3.3 給藥 將造模成功的新西蘭大白兔隨機分為含藥納米凝膠組、空白納米凝膠組、陽性對照Va組以及模型組，每組6只。給藥，每日1次，每次1 g[16]。

3 結果

3.1 納米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇的含量測定結果 將“2.2”項下制備的納米乳用甲醇稀釋適當倍數后，按“2.1”項下進行色譜分析，色譜圖見圖1，秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇在納米乳中的含量，見表1。

圖1 納米乳中秦皮甲素、白藜蘆醇、光甘草定HPLC色譜圖

表1 納米乳中秦皮甲素、光甘草定、白藜蘆醇的含量

3.2 納米乳包封率 納米乳中秦皮甲素、白藜蘆醇、光甘草定的包封率分別為（91.53±0.72）%、（92.85±0.37）%與（91.26±1.15）%，表明絕大部分藥物被包封在油相內部。

圖2 納米乳粒徑

圖3 納米乳Zeta電位

3.3 納米乳的粒徑與電位 將納米乳稀釋后用納米顆粒分析儀測定其粒徑與電位。納米乳的粒徑為（11.5±0.26）nm，PDI為 0.195±0.004，見圖 2，納米乳的 Zeta電位為（-11.9±0.1）mV，見圖 3。

3.4 形態觀察 TEM觀察納米乳的形態時，鏡下情況如圖4所示，納米乳為規則球形，分布均勻，無聚集、黏連的小液滴。

3.5 造模結果 未涂抹油酸的兔耳柔軟光滑，可見清晰的毛細血管。涂抹油酸3 d后，兔耳有發紅、發熱、耳腫脹的現象，第5天出現痂皮，第13天涂抹油酸的兔耳毛囊口隆起呈丘疹狀，如圖5所示，提示痤瘡模型建造成功。

HE染色結果顯示正常組：兔耳表皮較薄，細胞排列整齊，角化正常，可見毛囊，未見毛囊融合和擴張。模型組：表皮可見角化過度或角化不全，表皮和毛囊上皮顆粒層增厚、棘層肥厚，相鄰擴張的毛囊相互融合，毛囊口及漏斗部充滿角化物質，毛囊漏斗部擴大呈壺狀，真皮淺層毛細血管擴張，毛囊周圍可見大量中性粒細胞浸潤，見圖5，提示痤瘡模型建造成功。

3.6 給藥結果 給藥7 d后，含藥納米凝膠組、空白納米凝膠組、陽性對照Va組與模型組的痤瘡情況相比較，含藥納米凝膠組和陽性對照Va組痤瘡有明顯好轉，痤瘡程度減輕，表面平滑，已接近正常組織，空白納米凝膠組和模型組痤瘡仍存在，自愈部分表面均留下了不同程度的斑痕，如圖6所示。結果顯示本實驗制得的含藥納米凝膠對于痤瘡及留下的斑痕有良好的治療作用。

圖4 納米乳TEM圖

圖5 兔耳痤瘡模型建立過程圖

圖6 給藥7 d后痤瘡的治療效果圖

4 討論

據報道，痤瘡的發病機制與細菌、遺傳、內分泌障礙及情緒等因素有關[17]。目前認為表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、大腸桿菌與痤瘡的發病密切相關[18]。目前治療痤瘡的化學藥物副作用大，如維A酸類藥物具有致畸性，在臨床上限制了其使用，傳統中藥對痤瘡治療效果好，但由于使用不方便，限制了其發展，本文將中藥中有效成分配伍制成凝膠劑，不但起到了協同增效的作用，而且還方便了日常的使用。

光甘草定的用量為0.001%～3%時，可達到美白抗衰的效果，外用光甘草定有很好的抗氧化和抑制酪氨酸酶的作用，能淡化皺紋和色斑，當用量為0.01%～0.5%時，還有治療痤瘡的作用。白藜蘆醇不僅能夠抑制酪氨酸酶的活性，起到美白的作用。還對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有良好的抑菌作用，能治療炎癥。本實驗經過前期研究發現當白藜蘆醇與光甘草定的配比為2∶8時，對酪氨酸酶的活性有很好的抑制作用。因此，本實驗采用2∶8的比例，同時聯合抗炎效果良好的秦皮甲素，達到治療痤瘡、皮膚粗糙老化，淡化色斑的作用。

5 結論

秦皮甲素、光甘草定及白藜蘆醇組分配伍制備的納米乳為分布均勻，無聚集、無粘連的小液滴，該納米乳凝膠對兔耳痤瘡模型具有良好的治療作用。