Wolbachia對土耳其斯坦葉螨生殖影響的轉錄組測序分析

張燕娜　趙倩　趙伊英

摘要 為進一步探索內共生菌Wolbachia對土耳其斯坦葉螨生殖調控的影響，本試驗篩選出完全感染Wolbachia和完全不感染的土耳其斯坦葉螨品系進行轉錄組測序。結果表明：感染Wolbachia后，葉螨體內一些與生殖相關的基因發生明顯變化，其中3 810個基因在雌成螨中受到影響，2 885個基因在雄成螨中受到影響;其中一些參與脂質轉運、氧化還原反應、消化及解毒作用的基因具有明顯的性別特異性。這為內共生菌Wolbachia引起宿主生殖調控提供了新的理論依據。

關鍵詞 土耳其斯坦葉螨; Wolbachia; 轉錄組; 生殖調控

中圖分類號：

S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018389

Transcriptome sequencing and analysis of the effects of Wolbachia on the

reproduction of Tetranychus turkestani

ZHANG Yanna， ZHAO Qian， ZHAO Yiying*

（College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi 832000， China）

Abstract

To further explore the effects of endosymbiotic bacteria Wolbachia on reproduction of Tetranychus turkestani， the completely single-infected and uninfected T.turkestani lines were established and their transcriptomes were sequenced. The results showed that after infection with Wolbachia， some genes related to reproduction in the mites showed significant change， in which 3 810 genes were affected in female adult mites and 2 885 genes were affected in male mites. Some of the genes involved in lipid transport， redox reaction， digestion and detoxification were closely related to gender specific. Our study provides a new theoretical basis for the host reproductive regulation by Wolbachia.

Key words

Tetranychus turkestani; Wolbachia; transcriptome; reproductive regulation

內共生菌廣泛分布于昆蟲體內，如頭、胸、腹、唾液腺、消化道等[1];其分布受許多因素影響，胚胎發育過程是最主要的因素之一[2]。昆蟲與體內共生菌形成密切的互利共生關系[3]，內共生菌不僅能為宿主昆蟲提供多種必需營養物質[4-5]，保護宿主免受病原菌侵害，抵御病原微生物侵染[6]，還能通過調節宿主耐熱性、抗藥性及改變體色等途徑提高昆蟲對環境的適合度[7-9]。由此可見，內共生菌是調控宿主昆蟲新陳代謝及生物學性狀的重要因子。

Wolbachia是自然界迄今為止分布最廣泛的內共生菌，約有65%的昆蟲受其感染[10-11]。作為生殖調控因子，Wolbachia可誘導胞質不親和性（CI），即被Wolbachia感染的雄性個體與未感染的雌性個體或感染不同株系Wolbachia的雌性個體交配后不能或很少產生后代，或者后代偏雄性的現象; 或通過孤雌生殖或殺雄作用來提高后代雌蟲比例，影響種群動態[12-14]。研究已經證實感染Wolbachia后，在黑腹果蠅Drosophila melanogaster幼蟲睪丸中發現與生殖有關的基因發生了下調，Wolbachia還可使黑腹果蠅產生對RNA病毒的抗性[15-16]。土耳其斯坦葉螨Tetranychus turkestani是新疆棉田的重要害螨[17-18]，其體內Wolbachia可以誘導宿主產生胞質不親和作用[19-20]，還可以通過增加雌性繁殖力來影響土耳其斯坦葉螨的適合度[21]。

在本研究中，我們通過比較感染和未感染Wolbachia的雌成螨和雄成螨的轉錄組測序數據，探究Wolbachia對宿主生殖調控的影響。發現Wolbachia影響葉螨許多基因的表達，包括氧化還原、消化解毒和繁殖等的基因。研究結果為節肢動物和內共生菌之間復雜的相互作用提供了新的見解。

1 材料和方法

1.1 試驗葉螨的飼養及樣品收集

土耳其斯坦葉螨：2016年6月采自石河子大學農學院試驗站試驗田，在石河子大學昆蟲生理實驗室光照培養箱（25℃，L∥D=16 h∥8 h，RH 60%）中用豇豆Vigna sinensis飼養至今，飼養過程中未接觸任何藥劑。

1.2 土耳其斯坦葉螨Wolbachia感染情況檢測

土耳其斯坦葉螨總DNA的提取采用苗慧等[22]的方法：挑取單頭健壯雌成螨置于裝有25 μL STE緩沖液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0）的1.5 mL離心管內，用塑料碾槌充分碾碎，然后加入2 μL蛋白酶K（10 mg/mL），以上過程均在冰上完成。然后將離心管于37℃孵育30 min，95℃初始變性5 min，離心1～2 min后，-20℃保存或取2 μL作為PCR反應的模板，立即進行PCR擴增。

設計Wolbachia的wsp基因特異性引物WSP/F236（5′-GACAGTTTAACAGCATTTTCAGGA-3′）和WSP/R44（5′-GTTTGATTTCTGGAGTTACATCAT-3′），

DNA擴增條帶為211 bp

。反應總體系為25 μL：2 μL DNA模板，14.8 μL ddH2O，2.5 μL 10×buffer，1.5 μL MgCl2，

2.0 μL dNTPs，

0.2 μL Taq DNA聚合酶，上、下游引物各1 μL; 擴增條件： 94℃ 預變性2 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環;72℃延伸5 min。取PCR產物15～20 μL，用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Bio-RadGel DocEQ凝膠成像系統下觀察結果。

1.3 土耳其斯坦葉螨品系篩選

采用苗慧等[22]的方法篩選感染Wolbachia的土耳其斯坦葉螨品系：在裝有海綿的培養皿中（直徑9 cm）放入完整的新鮮四季豆葉片，根據葉片大小用濕潤脫脂棉條將其劃分成3～5個面積近似的小室。從實驗室品系中挑取靜Ⅲ態未經過交配的雌螨放入小室中單獨培養，使其進行產雄孤雌生殖，待后代雄螨發育為成螨后，將母體與其雄螨后代回交。回交2 d后，將母體轉移到新的小室中產卵，7 d后對母體進行PCR檢測。將感染Wolbachia的雌螨所產的后代重復以上步驟3～5代后，挑取50頭左右進行PCR，檢測Wolbachia感染率，達到全部感染用于后續測序試驗。

抗生素處理篩選不感染Wolbachia的品系：挑取土耳其斯坦葉螨新孵化的幼螨（尚未進食，近白色）放在特制的玻璃皿里，用0.3%的四環素溶液飼喂48 h。在裝有海綿的培養皿中（直徑9 cm）放入完整新鮮四季豆葉片，四周圍上濕潤的脫脂棉條防止葉螨逃逸。將處理后的幼螨挑到葉片上，使其自然生長并繁殖后代。以后每日向培養皿中加入蒸餾水以保持海綿的濕潤，并及時更換新鮮的葉片。幼螨成熟后，挑取50頭左右進行PCR，檢測Wolbachia的感染情況，若全部個體均不感染Wolbachia，則將該品系后代繼續培養3至5代，用于后續測序試驗。

1.4 供試樣品轉錄組測序

收集感染和不感染Wolbachia的土耳其斯坦葉螨雌螨（分別編號為A_W_F和A_F，F表示雌性;W代表Wolbachia）及雄螨（編號為A_W_M和A_M，M表示雄性），3次重復。樣品收集好后，快速置于液氮中，用于后續試驗。采用天根TRNzol Universal總RNA提取試劑（DP431）提取供試土耳其斯坦葉螨總RNA，步驟參考說明書。轉錄組測序工作委托北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.5 實時熒光定量PCR鑒定

為了檢測RNA-Seq分析的準確性，根據轉錄組測序數據篩選基因序列，利用Primer Premier 5進行引物設計及驗證（表1），將提取的供試材料RNA通過TaKaRa公司Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄獲得cDNA第一鏈，取5 μL合成產物稀釋10倍用于試驗，根據TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM（商品編號為DRR420S）說明書進行熒光定量PCR反應（ABI 7300），每個反應重復3次。使用2-ΔΔCT方法計算相對表達量[23]。

2 結果與分析

2.1 有參轉錄組測序結果分析

利用Illumina測序技術對感染Wolbachia和未感染Wolbachia的土耳其斯坦葉螨的雌成螨和雄成螨分別進行轉錄組測序。感染Wolbachia的雌成螨平均獲得24 117 129 clean reads，比對到參考基因組的reads數目為40 957 849，占clean reads的84.91%，比對到參考基因組唯一位置的reads數目為39 924 187，占所有reads的82.78%， GC平均含量為36.93%。感染Wolbachia的雄成螨平均獲得21 783 386 clean reads，比對到參考基因組的reads數目為35 671 706，占clean reads的81.89%，比對到參考基因組唯一位置的reads數目為34 743 136，占所有reads的79.75%， GC平均含量為36.24%（表2）。

2.2 差異表達基因的GO分析

GO功能分類發現，在雌成螨中感染Wolbachia 品系變化明顯的主要有以下幾個方面： 生物過程中的細胞蛋白質代謝過程、病毒-宿主交互作用、磷酸鹽化合物代謝過程及應激反應;分子功能中的氧化還原酶活性、RNA結合、轉移酶活性及核苷酸結合蛋白（圖1a）。在感染Wolbachia的雄成螨中包括生物過程中的有機氮化合物代謝過程、轉運和肽生物合成;分子功能中為參與

氧化還原過程的GTP酶活性、鋅離子結合及核苷酸結合（圖1b）。在整個感染過程中，雌成螨和雄成螨都做出了相應的應激反應。

2.3 差異表達基因KEGG富集分析

對差異表達基因進行KEGG通路分類注釋，并對感染Wolbachia的雌雄螨的差異表達基因富集度最高的10個通路進行比較，結果表明： 在雌成螨中，Wolbachia感染品系中的差異表達基因主要集中到80個KEGG途徑，其中顯著富集的代謝途徑主要涉及核糖體、氧化磷酸化、吞噬和RNA轉運等（圖2a）。在雄成螨中，差異表達基因主要集中到81個KEGG途徑，其中顯著富集的代謝途徑主要涉及蛋白酶體、吞噬、RNA轉運、蛋白質輸出、MAPK信號通路及mRNA監測途徑（圖2b）。

2.4 差異表達基因篩選

以不同試驗條件下的差異表達基因的FPKM值為表達水平，進行層次聚類（hierarchical clustering）分析，不同顏色的區域代表不同的聚類分組信息，同組內的基因表達模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程，結果顯示，基因表達都是特異性的，A_W_M與A_M及A_W_F與A_F之間的比較表明，每一個文庫都有獨特的轉錄變化（圖3），這表明有許多基因受到了內共生菌Wolbachia的影響，盡管不能排除在篩選完全不感染Wolbachia品系過程中殘留的抗生素引起的基因差異。

對樣本cluster后的unigene進行差異表達分析。以log2FoldChange>1且P<0.05為標準進行樣本間的差異表達基因篩選，完全單感染Wolbachia的雌成螨和完全不帶菌的雌成螨相比上調表達的基因有1 806個，下調表達基因有2 004個;完全單感染Wolbachia和完全不帶菌的雄成螨相比有1 057個基因上調表達，1 828個基因下調表達（圖4）。

為深入了解內共生菌Wolbachia對葉螨的影響，我們將變化明顯的差異表達基因列表分析（表3）。已知細胞色素P450、谷胱甘肽S-轉移酶及ABC轉運蛋白是葉螨體內最常見的幾種解毒代謝基因，受Wolbachia感染后的雌成螨中有4種P450，雄成螨中有6種P450，它們大多數為上調表達。3個谷胱甘肽S-轉移酶基因在雌成螨中全部為上調表達，而在雄成螨中編碼谷胱甘肽S-轉移酶基因（107360606）為下調表達。4個ABC轉運蛋白基因在雌（novel.5873、novel.11318、107366618和107362311）、雄螨（107366618和107362311）中均為下調表達。

脂質運載蛋白（lipocalin）是能夠結合疏水性的小分子蛋白質，受Wolbachia感染后雌雄螨中全部表現為下調表達（雌性中4個，雄性中2個; 表3）。一些與生殖功能相關的基因如組蛋白基因、編碼卵黃蛋白的基因（107370220）、innexin inx2（107366133、107365265等）、附睪分泌蛋白（107365091、107365137等）、cathepsin（107371482、107364383等）等受內共生菌Wolbachia感染后發生了明顯的上調或下調變化，這可能影響了卵子或胚胎的形成。

2.5 差異表達基因的qRT-PCR熒光定量分析

隨機篩選雌雄螨各8個差異表達基因（上調5個，下調3個）采用熒光定量PCR驗證RNA-Seq測序結果。結果顯示，實時熒光定量PCR與轉錄組測序的結果在基因表達變幅上有一定的差異，但基因的表達趨勢是一致的（圖5），驗證了轉錄組測序結果的可靠性。

3 討論

Wolbachia是廣泛存在于節肢動物體內的共生細菌，可通過宿主卵的細胞質進行母系遺傳，并且能夠通過不同的方法調控寄主的生殖，實現其在宿主種群中的穩定存在和傳播。有研究表明Wolbachia可以在分子水平和細胞水平上與其宿主之間進行相互作用，誘導宿主強胞質不親和性，并提高雌性的繁殖力[21-24]。Wolbachia增加了D.mauritiana的繁殖力和生殖系干細胞的有絲分裂活性，并減少了卵巢中的程序性細胞死亡[25]，Wolbachia誘導的胞質不親和性強度隨著雄性年齡和幼蟲階段發育顯著降低[26]。本研究中，我們選取完全感染Wolbachia和完全不感染Wolbachia的土耳其斯坦葉螨作為試驗材料，挑選1日齡的雌成螨和雄成螨進行轉錄組測序，結果顯示：與卵子或精子形成相關的基因，如組蛋白基因、卵黃蛋白基因、組織蛋白酶B等發生了明顯的變化。卵黃原蛋白（vitellogenin， Vtg）作為卵黃蛋白（yolk protein， YP）的前體參與卵生動物的卵子發生。卵黃蛋白對于卵母細胞的生長和分化以及將金屬離子、脂質和維生素運送到卵母細胞中起重要作用[27-28]。受Wolbachia感染之后，雌成螨中編碼卵黃原蛋白的基因（107370220）發生了明顯的下調，推測其可能在增強雌性的生殖力方面起作用。

組蛋白磷酸化是組蛋白氨基酸殘基的磷酸化修飾，是一類重要的翻譯后修飾，與有絲分裂和減數分裂的染色質壓縮、染色質功能調節、轉錄的激活與抑制、DNA 損傷修復以及物質代謝等多種機制相關[29]。本研究發現，感染Wolbachia的雄成螨中編碼組蛋白H2B的基因（107360201，log2FC-5.10）發生了顯著下調。組蛋白 H2B 主要以變異體 TH2B 和 H2BFW 形式特異地存在于雄性生殖細胞系中，體細胞系中沒有變異體，其可能參與調控特殊染色質區域的基因轉錄。潘曉燕等[30]和Lu等[31]在小鼠精子發生不同階段檢測到了睪丸特異組蛋白 TH2B 的第 116 位蘇氨酸的磷酸化。研究證實， TH2B 磷酸化在減數分裂后染色質折疊和壓縮過程中發揮了直接的調控作用。而感染Wolbachia的雄成螨，編碼組蛋白 H2B的基因表達量大幅下調，可能會影響雄性精子的生成。H3.3 是重要的母源因子，在正常受精后精子的重編程以及體細胞核移植后供體細胞核的重編程過程中起重要作用。在正常受精過程中，H3.3 能替換精子中的魚精蛋白，將其重編程為雄原核[32]。感染Wolbachia的雌雄成螨中編碼組蛋白H3.3的基因發生了明顯的變化，也有可能引起雄性不育現象的發生。

Inx 基因在動物體內的分布比較廣，Inx2在控制果蠅胚胎前腸的發育等方面發揮著重要作用[33]。Lehmann 等[34] 的研究表明，Inx2蛋白和 Inx3 蛋白在膜上的分布和定位相互影響，當沉默 Inx2 基因的表達時，Inx3 蛋白會在細胞中積累并分布紊亂，反之亦然。Inx2和Inx3基因協同表達后通過細胞內的C端功能域相互作用形成異聚化的 Inx2∶Inx3 通道，這對果蠅胚胎上皮組織發育和胚胎表皮極性形成起著關鍵作用。如果Inx2 或 Inx3 發生突變，會導致表皮上有大的皮孔形成，極端情況下甚至導致外皮的缺失。感染了Wolbachia后，雌雄成螨中Inx2發生了不同程度的上調或下調變化，而Inx3都趨于穩定，這將導致Inx2∶Inx3的比例不平衡，影響胚胎的正常發育。

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（責任編輯：田 喆）