Phaeosphaeriasp.HD-06菌株對馬唐的致病性分析及初步鑒定

鄒德勇　楊智越　杜春梅

摘要 為了得到能夠有效抑制馬唐Digitaria sanguinalis生長的生防微生物，在農田采集馬唐種子，進行萌發試驗，觀察種子的萌發狀況，從發病的種子和馬唐幼苗基部分離致病菌，通過形態學觀察以及ITS 序列分析對致病菌進行鑒定。結果從罹病的馬唐幼苗基部分離得到一株致病菌HD-06，該菌株的發酵液用水稀釋至60%濃度時，對馬唐種子的萌發抑制率和幼苗發病率均達到100%，這說明菌株HD-06對馬唐有較好的生物防治作用。根據其形態學特點及ITS 序列分析結果，鑒定菌株HD-06為暗球腔菌屬Phaeosphaeria的真菌。這些結果為深入研究其對馬唐的防治作用奠定了基礎。

關鍵詞 馬唐; 生防菌; 致病性; 鑒定

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019166

Pathogenicity of Phaeosphaeria sp. HD-06 against Digitaria sanguinalis and the preliminary identification of the strain

ZOU Deyong1，2， YANG Zhiyue3， DU Chunmei1，2*

（1. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University，

Harbin 150500， China; 2. Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences，

Heilongjiang University， Harbin 150080， China; 3. Harbin Xingpu Feed Company， Harbin 150010， China）

Abstract

In order to obtain the effective biocontrol microorganism for inhibiting the growth of Digitaria sanguinalis， the seeds of crabgrass were collected in the farmland， and seed germination test was carried out. The germinating situation was tracked over time; meanwhile， the pathogens were isolated from the diseased seeds and the seedling base， and morphological observation and ITS sequence analysis were conducted to identify the pathogenic fungi. The results showed that a disease-causing strain named HD-06 was successfully isolated from diseased crabgrass seedling base. When the fermentation broth of strain HD-06 was diluted by 60% with water， the germination inhibition rate and seedling disease incidence rate of crabgrass reached 100% after treatment. It indicated that strain HD-06 had a good biological control effect on crabgrass. According to the morphological characteristics and ITS sequence analysis results， strain HD-06 was identified as a fungus of the genus Phaeosphaeria. These results laid a foundation for further research on its control effect on crabgrass.

Key words

Digitaria sanguinalis; biocontrol bacteria; pathogenicity; identification

馬唐Digitaria sanguinalis是禾本科單子葉植物，是一種秋熟作物農田中的雜草，在熱帶和溫帶地區的36個國家均有分布，對30多種農作物的生產有嚴重危害[1]。由于馬唐具有極強的抗逆能力和營養競爭力，能夠在水、旱等多種類型的連作農田中快速蔓延，極難防除，被列為18種惡性雜草之一[2]。化學農藥的長期施用導致馬唐已經對草甘膦[3-4]、氟磺草胺、噁唑酰草胺、精噁唑禾草靈、煙嘧磺隆[5-6]等多種除草劑產生了抗藥性。而一些化學除草劑具有的潛在致癌致畸毒性也導致人們對其應用產生了一定的抵觸心理。而生物除草劑具有無毒、無害、無污染、生物安全性高，且不易產生抗藥性等優點，成為化學農藥的良好替代品，引起人們的廣泛關注。

目前國內外可用于防除雜草的真菌主要有10屬8種[7]，其中柄銹菌屬Puccinia sp.、鐮刀菌屬Fusarium sp.、尾孢屬Cercospora sp.、鏈格孢屬Alternaria sp.等的種類較多，目前在生產中應用的真菌除草劑主要有Collegeo（主要成分為盤長孢狀刺盤孢Colletotrichum gloeosporioides）、Devine（主要成分為棕櫚疫霉Phytophthora palmivora的厚垣孢子懸液）、魯保一號（主要成分為膠孢炭疽菌菟絲子專化型Colletotrichum gloeosporioides（Penz.） Sacc. f.sp. cuscutae）和Biochon（主要成分為銀葉菌Chondrostereum purpureum）以及敵散克（主要成分為畫眉草彎孢霉菌Curvularia eragrostidis QZ-2000），其中敵散克是主要針對馬唐研制的真菌除草劑[8]。另外，許多細菌及其代謝物也具有防除馬唐的作用，如日本研發的細菌除草劑Camperico（主要成分為甘藍黑腐病黃單胞菌Xanthomonas campestris pv. campestris JT4P82）已經商品化，鏈霉菌Streptomyces sp.638產生的茴香霉素能防除馬唐和稗草[9]，假單胞菌、歐文氏菌、細菌S4[10]對馬唐也具有良好的防效。盡管已報道的對馬唐有致病性的菌株有很多，但是真正商品化的防除馬唐的微生物制劑種類相對較少，且由于各種生防菌株的寄主范圍不同，其應用往往受到一定的限制，不能完全滿足生產的需要。因此，繼續分離、篩選和鑒定馬唐生防菌株能夠為研發新型、高效的生物除草劑提供微生物品種資源，具有重要的科學意義和廣泛的應用前景。

已報道的馬唐致病菌多是從罹病的葉片分離得到的，極少有從種子和罹病幼苗上分離得到[11]。黑龍江大學微生物學重點實驗室從罹病馬唐幼苗的基部分離到一株能夠有效抑制馬唐種子萌發和幼苗生長的生防菌株，對其進行了形態學觀察和ITS序列分析，為后續進一步研究其防除馬唐的機理，開發新型除草劑奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬唐種子：鑒于秋季采集的馬唐種子萌發率較低，而越冬的種子萌發率較高，本試驗采用的種子為3月末從黑龍江省齊齊哈爾市梅里斯區雅爾塞鎮農田采集的自然條件下越冬的種子。

培養基：以馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）為固體培養基，在PDA的基礎上，不添加瓊脂為液體培養基，121℃滅菌20 min。

試劑：葡萄糖、瓊脂、次氯酸鈉、CTAB、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、溴化乙錠、瓊脂糖、dNTPs（2.5 mmol/L）、10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶和DNA Marker DL2000，均購于寶泰克有限公司。

儀器：DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠;Omega 10 UVP凝膠成像系統，德國UVP公司;TC-512 Thermal CylerPCR儀，英國Techne公司;CX31體視顯微鏡，奧林巴斯有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬唐病原真菌的分離

挑選外觀成熟飽滿的馬唐種子，用2%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗3遍，用滅菌濾紙吸干種子表面殘留的水分后，置于鋪有滅菌的濕潤濾紙的培養皿中，每皿加10 mL無菌水， 25℃恒溫保濕培養7 d，觀察萌發情況，分別挑取發病種子和發病幼苗上的菌絲體接種于PDA培養基上，待菌落形成后，挑取菌落邊緣的菌絲體，純化培養，備用。

1.2.2 馬唐生防菌株的篩選

用無菌水沖洗各分離株培養物表面，制成1×106個/mL的孢子懸浮液，對馬唐種子浸種處理6 h，以無菌水為對照。然后置于鋪有滅菌濾紙的無菌PDA培養皿中，每皿50粒，每處理3次重復，25℃光照培養箱中保濕培養，記錄種子萌發率，計算萌發抑制率。

1.2.3 菌株HD-06的發酵液對馬唐的致病性

皿栽試驗：將菌株HD-06在PDA培養基上培養5 d，挑取菌絲體，接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中（每瓶裝液量為50 mL/250 mL）中，28℃，180 r/min發酵培養4 d。發酵液用無菌水稀釋至終濃度分別為60%、40%和20%，對馬唐種子進行浸種處理，以無菌培養基作為對照，然后置于鋪有滅菌保濕濾紙的無菌培養皿中進行萌發試驗，每處理3次重復，調查種子的萌發率和萌發6 d后幼苗的發病率。

盆栽試驗：為模擬大田土壤生態環境，采用未滅菌的花壇土壤進行盆栽試驗。將花壇土與蛭石按照1∶1的比例混合。選取直徑15 cm，高度14 cm的花盆，盆內裝2/3的土。 每盆播撒100粒成熟飽滿的馬唐種子，對照組噴施20 mL無菌發酵培養液，處理組噴施20 mL發酵培養4 d的HD-06含菌發酵液，然后覆土1 cm，表層土壓實平整后，室內自然溫度條件下培養。每處理3盆。定期觀察記錄各處理馬唐生長情況，在接種37 d后進行調查并記錄數據。

1.2.4 生防菌株的鑒定

1.2.4.1 形態觀察

將菌株HD-06接種于PDA平板上，28℃連續培養25 d，定期對菌株形態進行觀察，測量和拍照。

1.2.4.2 分子生物學鑒定

采用CTAB法提取真菌DNA，采用上海生工生物公司合成的引物 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）對菌株的ITS序列進行PCR擴增[12]。50 μL PCR反應體系：10 μmol/L的上游引物和下游引物各2 μL、DNA模板2 μL、10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 1 μL、5 U/μL TaqDNA聚合酶1 μL，補充ddH2O至50 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性5 min;95℃變性1 min，54℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環34次，產物送博仕生物公司進行測序。在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析，并應用MEGA 5.1軟件構建系統發育樹，初步確定其系統發育地位。

根據生防真菌的形態學特征及ITS序列分析，查閱植物病原真菌鑒定手冊和相關文獻，明確其分類地位[13]。

1.3 計算和統計方法

萌發抑制率=（未萌發種子數/種子總數）×100%，利用SPSS軟件Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析。種子萌發率=（已萌發種子數/種子總數）×100%，致病率=（發病株數/萌發總株數）×100%，用EXCEL軟件t測驗法分析檢驗處理間的效應，用SPSS軟件LSD法檢驗平均值之間的差異。

2 結果與分析

2.1 馬唐生防菌株的分離和篩選

從馬唐種子和罹病幼苗基部共分離得到6株真菌。它們對馬唐種子的萌發均表現出一定的抑制作用（表1），其中菌株HD-06處理對馬唐種子的萌發抑制率最高，為43.0%，方差分析結果表明，各菌株間的萌發抑制率差異達到顯著水平（F=38.95，P<0.05）。

2.2 菌株HD-06發酵液對馬唐的致病性

皿栽試驗結果表明（表2，圖1），當對照組馬唐種子的萌發率達到90%時，菌株HD-06的20%、40%和60%濃度發酵液處理的種子萌發率僅為30%、10%和0（F=1 733.33，P<0.01），差異達到極顯著水平，說明HD-06的發酵液對馬唐種子的萌發具有較好的抑制作用。各處理植株情況見圖1，對照（圖1a）幼苗葉片鮮綠，芽長和根長顯著高于各發酵液處理（芽長F=13.1，P<0.05;根長F=510.75，P<0.01）（圖1b、c），而發酵液處理的種子已多數霉爛發病，看不出種子原來的形狀，只能看到致病菌的霉層和菌絲體;少數萌發并長成幼苗的種子，其長勢、芽長、根長均顯著低于對照（圖1d）。雖然已萌發種子的霉爛程度要輕于未萌發的種子，仍能清晰地看出種子的形狀，但其莖部和根部呈現明顯的水漬狀，且葉片明顯變黃（圖1e）。

盆栽試驗結果（表3）表明，對照組與處理組間的發芽率、致病率、株高以及單株地上部干重都存在顯著差異（發芽率F=45.0，P<0.01;致病率F=74.33，P<0.01;株高F=13.77，P<0.05;單株結籽數F=1.94，P>0.05;單株地上部干重F=64.66，P<0.01）。說明施用菌株HD-06可以起到抑制馬唐種子萌發和幼苗生長的作用，具有較好的除草潛力。當然，可能由于土壤中的狀況比較復雜，有較多的物理化學和生物方面的因素影響馬唐的萌發和生長，導致盆栽防治效果不如皿栽防治效果好。這也說明，要想讓生防菌株在田間表現更好的除草效果，除了需要高效菌株外，還需要合理的制劑方案，使用合理的助劑和施用方法，才能進一步提高微生物除草劑的應用效果。

2.3 菌株HD-06的鑒定

2.3.1 形態觀察

對菌株HD-06的形態觀察結果表明，在PDA培養基上，菌落正面藍灰色，菌絲向上生長，毛絨狀;菌落背面黑褐色，能觀察到小黑點狀的子囊殼，針刺時有堅硬感。培養15～20 d時，挑取小黑點部位壓碎制片，在顯微鏡下觀察，能看到大量的子囊簇生在墊狀結構上（圖2a）。子囊頂端圓，壁薄，圓柱狀，大小為（52～103）μm×（7.7～11.6）μm，內含有8個子囊孢子，具有膠質鞘（圖2b）;子囊孢子單列至3列，多為紡錘形，直或稍彎曲，大小（20.6～36）μm×（3.9～5.2）μm，L/W約為5.2，被5個隔膜分成6個細胞，中間細胞膨大，一端細胞略尖，另一端有一個尖細的柄細胞（圖2c， d， e），中間的2～3個細胞均分布有較多的滴狀油球。子囊孢子為黃綠色，中間兩個細胞顏色較深（圖2c， e）。孢子萌發時，顏色變深，呈褐色，細胞整體明顯膨大，尤其是頂部細胞膨大成鈍圓狀，孢子一端萌發出絲狀體（圖2e）。

2.3.2 菌株HD-06的ITS序列分析

菌株HD-06的ITS序列長度為613 bp，將ITS序列提交到NCBI數據庫中，應用BLAST軟件從數據庫中搜索出相關菌株的ITS序列，與已知菌的ITS序列進行同源性比較，分析其系統發育關系。GenBank數據庫比對結果表明，菌株HD-06的ITS序列（MK110375）與座囊菌綱格孢腔菌目的暗球腔菌屬真菌Phaeosphaeria sp. CBS123.76（KF251194.1）和小球腔菌屬Leptosphaeria sp. VegaE4-83（EF694661.1）相似度均為99%，集合在同一大分支（圖3），且暗球腔菌屬真菌和小球腔菌屬真菌的ITS序列在系統發育上極為相近，即菌株HD-06可能是格孢腔菌目真菌中的暗球腔菌屬或小球腔菌屬真菌。

2.3.3 鑒定結論

菌株HD-06的形態學特征符合子囊菌亞門座囊菌綱格孢菌目的形態學特征[14]。暗球腔菌屬Phaeosphaeria 和小球腔菌屬 Leptosphaeria 都是格孢腔菌目中的大屬，而且親緣關系較為相近，它們的ITS序列在系統發育上界限并不清晰，建屬初期關于它們的分類學地位一直存在爭議[15]。Holm在格孢菌科的研究中，將Phaeosphaeria界定為一個獨立的屬，理由是這類菌的子囊座具有擬側絲，將P.oryzae I. Miyake定為模式種，并將原來屬于Leptosphaeria Ces. & De Not. 的17個具有由擬

薄壁組織構成的小子囊座和具單子葉植物寄主的種移入Phaeosphaeria中[16]。李文英等利用18S和28S

序列對座囊菌目及相關類群屬間關系的系統學進行了初探，發現格孢腔菌目參試的 7 個屬形成一個單系群，但屬間的支持率非常低[17]。分子系統學研究表明子囊及子囊孢子的形態及寄主范圍（侵染單子葉植物的通常為Phaeosphaeria，侵染雙子葉植物的通常為Leptosphaeria）對界定這兩個屬菌株的分類地位非常重要[18]。菌株 HD-06所侵染的馬唐為單子葉植物，因此，根據其寄主，我們將菌株HD-06初步鑒定為暗球腔菌屬Phaeosphaeria真菌。

3 討論

馬唐是世界性惡性雜草，現有的微生物源除草劑還不能滿足農業的需求。因此，廣泛篩選對馬唐具有防除作用的生防微生物，具有較重要的科學意義。我們分離到的生防真菌HD-06的發酵液能夠抑制馬唐種子的萌發，對馬唐幼苗有強致病性，具有開發為生物除草劑的潛力，經形態學、分子生物學特性及其侵染單子葉植物的綜合特征，鑒定該菌株為暗球腔菌屬真菌。目前相關文獻已經報道了10個屬的真菌對馬唐具有良好的防除效果，包括刺盤孢屬Colletotrichum、疫霉屬Phytophthora、鐮刀菌屬Fusarium、交鏈孢屬Alternaria、柄銹菌屬Puccinia、尾孢屬Cercospora、葉黑粉菌屬Entyloma、殼單孢菌屬Ascochyta、核盤菌屬Sclerotinia、彎孢屬Curvularia[19]，而上述10個屬的真菌多數是從馬唐葉片分離得到的，至今未見有關在馬唐的種子上分離到暗球腔菌屬真菌的報道。菌株HD-06的分離與鑒定，擴大了馬唐生防菌的資源庫。

到目前為止，暗球腔菌屬Phaeosphaeria已有114個種[20]，中國對該屬研究報道較少，喬倩等曾報道了中國黃海黃島海域潮間帶木上的2個中國新記錄種新海暗球腔菌P.neomaritima 和高山暗球腔菌P.subalpina[21];于輝霞等報道了來自福建武夷山、安徽黃山和山東昆崳山的3個中國新記錄種，肩狀暗球腔菌P.humerata、馬西山暗球腔菌P.marciensis和香蒲暗球腔菌P.typharum[20]。但是在馬唐上未見分離到該屬致病真菌的報道。

4 結論

HD-06為暗球腔菌屬Phaeosphaeria真菌，該菌株60%濃度的發酵液對馬唐種子的萌發抑制率為100%，處理后馬唐幼苗發病率達到100%;在盆栽試驗中發現經其發酵液處理后的馬唐種子的萌發抑制率和幼苗發病率均遠遠高于空白對照組，且對馬唐植株的株高、結籽數以及干重都有顯著影響，顯示出對馬唐的萌發和生長都有很好的抑制效果。今后我們將對菌株HD-06的寄主范圍和安全性進行評估，對其侵染和發病過程進行觀察，分析其致病機理，并在此基礎上對其發酵條件進行優化，對發酵液中能夠防除馬唐的有效物質進行分離純化，為開發新型馬唐生物除草劑奠定基礎。

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（責任編輯：田 喆）