云南草地貪夜蛾擴散區與首發地種群腸道細菌群落組成結構及多樣性的比較

徐天梅　符成悅　蘇造堂　肖關麗　李維薇　陳斌

摘要 草地貪夜蛾是一種新入侵我國的重大害蟲。腸道細菌是昆蟲腸道微生物的重要類群，在害蟲生理生態功能中發揮著重要作用，為弄清云南省草地貪夜蛾擴散地與入侵地種群腸道細菌群落組成結構及多樣性的差異，本研究采用Illumina Hiseq技術對云南草地貪夜蛾首發地普洱市寶藏鎮、擴散區昆明市嵩明縣兩個地區草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA V3-V4變異區域序列進行了測定分析，應用USEARCH和QIIME軟件統計樣品序列數和操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數量分析了腸道細菌群落組成結構及物種豐度與多樣性。結果表明，來自普洱市寶藏鎮、昆明市嵩明縣的6個草地貪夜蛾樣品共產生了302 786條有效序列，在97%相似度下可將其聚成564個OTUs，共發現細菌20門、39綱、86目、161科、318屬、344種。其中寶藏鎮草地貪夜蛾種群的腸道細菌分屬于16門、29綱、60目、102科、178屬共192種;優勢門、綱、目、科、屬、種分別為：厚壁菌門（35.09%）、梭菌綱（15.84%）、梭菌目（15.84%）、艾克曼菌科（12.80%）、艾克曼菌屬（12.80%）、不可培養的艾克曼菌屬細菌（12.80%）。嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌共184種，分屬于15門、27綱、54目、96科、172屬;優勢門、綱、目、科、屬、種分別為：厚壁菌門（65.87%）、桿菌綱（48.07%）、乳桿菌目（47.32%）、腸球菌科（46.99%）、腸球菌屬（46.99%）、NLAE-zl-C485（46.96%）。寶藏鎮草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道內細菌群落Shannon、ACE和Chao1多樣性指數分別為3.46、360.25和370.54，分別高于擴散地嵩明縣種群的2.26、295.54和305.42;而Simpson指數（0.13）則低于嵩明縣種群（0.36）。通過KEGG代謝途徑差異分析發現，草地貪夜蛾腸道細菌基因主要參與的代謝途徑是整體組織構建和碳水化合物代謝，且寶藏鎮草地貪夜蛾腸道細菌基因在大多數的代謝通路中表達量高于嵩明縣種群。以上結果說明，云南省草地貪夜蛾首發地種群腸道內細菌群落組成及多樣性高于擴散區種群。本研究將為進一步研究不同地區草地貪夜蛾種群生物學差異及腸道微生物對其生態適應性的調控提供理論依據。

關鍵詞 草地貪夜蛾; 腸道細菌; 16S rDNA; 基因測序

中圖分類號：

S 435.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020083

Composition and diversity of gut bacteria community of Spodoptera frugiperda from the first invasion site and the dispersal area in Yunnan province

XU Tianmei1， FU Chengyue1， SU Zaotang1， XIAO Guanli2*， LI Weiwei1，3， CHEN Bin1*

（1. College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2.College of Agriculture & Biology Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

3. Kunming Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China）

Abstract

Fall armyworm， Spodoptera frugiperda， is a serious invaded pest insect of corn， it was firstly found in Baozang town， Yunnan province， China， in 2019. Gut bacteria played important role in the physiological and ecological function. To understand the difference of composition and diversity of gut bacteria communities in S.frugiperda from the first invasion site and the dispersal area， a comparable study on the intestinal bacteria of 4th instar larvae from Baozang and Songming populations of S.frugiperda was conducted using 16S rDNA V3-V4 variation region sequence based on the Illumina Hiseq technique. The sequence numbers of each sample and the numbers of operational taxonomic unit （OTU） were analyzed using the software of USEARCH and QIIME， and the species composition， abundance and diversity indexes of gut bacteria were determined. A total of 302 786 effective sequences were generated from six samples from two regions， which was aggregated into 564 OTUs under 97% similarity. A total of 20 phylum， 39 classes， 86 orders， 161 families， 318 genera and 344 species bacterial were annotated. For Baozang population， a total of 192 species which belong to 178 genus， 102 families， 60 orders， 29 classes and 16 phylum were identified， among which dominant phylum， class， order， family， genera and species were Firmicutes （35.09%）， Clostridia （15.84%）， Clostridiales （15.84%）， Akkermansiaeae （12.80%）， Akkermansia （12.80%） and uncultured Akkermansia bacterium （12.80%）， respectively. A total of 184 species which belong to 172 genus， 96 families， 54 orders， 27 classes and 15 phylum were identified in Songming population. Of which， dominant phylum， class， order， family， genera and species were Firmicutes （65.87%）， Bacilli （48.07%）， Lactobacilliales （47.32%）， Enterococcaceae （46.99%）， Enterococcus （46.99%）and NLAE-zl-c485 （46.96%）， respectively. The diversity indexes of Shannon index （3.46）， ACE （360.25）and Chao 1 （370.54） in the Baozang population were higher than those in the Songming population， which were 2.26， 295.54 and 305.42， respectively. But the Simpson index in the Baozang population （0.13） was lower than that in the Songming population （0.36）. Analysis of the KEGG metabolism pathway showed that the main metabolism pathway of gut bacterial was the whole tissue construction and carbohydrate metabolism， and the relative expression of gut bacterial genes in Baozang population was higher than that in Songming population. These results showed that the composition and diversity of gut bacterial community of S.frugiperda in the first invasion site was higher than those in the dispersal areas in Yunnan province. This study will provide a theoretical basis for further study on the variance of the biology of different populations and adaptation mechanism meditated by gut microorganisms.

Key words

Spodoptera frugiperda; gut bacteria; 16S rDNA; gene sequencing

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smith），又名秋黏蟲，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾屬Spodoptera[1]。該蟲具有較強的遷飛能力，繁殖能力強，生活周期短，是一種雜食性害蟲，能取食玉米、水稻、高粱和甘蔗等353種植物[2]。該蟲源于美洲熱帶及亞熱帶地區[3]，2016年傳入非洲，2018年入侵也門、印度和緬甸等亞洲國家， 2019年1月入侵云南省普洱市江城縣寶藏鎮[4-5]，此后迅速擴散，到2019年10月10日，已在我國26個省1 518個縣發生，為害的作物達15種。草地貪夜蛾主要寄主為玉米，其次為甘蔗、高粱、谷子、小麥等作物，給玉米生產造成了嚴重影響[6]。

昆蟲腸道微生物被認為是昆蟲的第二套遺傳密碼[7]，參與昆蟲體內許多重要的生理生化反應，如參與合成昆蟲所需營養物質[8]、幫助消化大分子物質[9]、介導抗藥性[10]、影響交配行為[11]、調控寄主選擇[12]和環境適應性[13]等。因此，關于昆蟲腸道微生物群落組成結構及多樣性的研究是近年來昆蟲學研究的熱點之一，這些研究為昆蟲與其腸道微生物的協同進化及害蟲防治提供了理論依據[14-16]。Almeida等[17]和Acevedo等[18]采用分離培養法分別對巴西和美國草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌群落組成結構進行了研究，發現草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌種類豐富;唐運林等[19]、顧偌鋮等[20]、韋俊宏等[21]對我國重慶巫溪與巫山地區、李青晏等[22]對云南蒙自地區草地貪夜蛾腸道細菌多樣性進行了測定分析，明確了當地草地貪夜蛾腸道可培養細菌種類，且發現其種類隨地區不同而存在一定差異。云南省昆明市嵩明縣為草地貪夜蛾入侵進入云南后的擴散地，該地區草地貪夜蛾種群腸道細菌組成與入侵地普洱市江城縣寶藏鎮草地貪夜蛾種群是否存在差異還不清楚。本文研究了兩地草地貪夜蛾種群幼蟲腸道細菌群落組成結構及其多樣性，這對于系統研究該蟲生物生態學具有重要意義。

目前，對草地貪夜蛾腸道微生物的研究主要是利用傳統培養法進行分離、培養和鑒定，唐運林等采用該方法從重慶巫溪和巫山等地區玉米地草地貪夜蛾腸道中分離并鑒定得到5個屬的細菌[19-21]，然而采用該方法不能鑒定不可培養細菌種類。隨著分子生物學技術的發展，16S rDNA基因序列測定、宏基因組測定（描述細菌的潛在功能）和宏轉錄組測序（描述活性基因的表達）[23]等技術為系統研究微生物提供了技術支撐，其中16S rDNA是一種重要的分子標記技術，通過獲得待測微生物的16S rDNA序列，與公共數據庫中已經研究的物種序列進行比較[24]實現種類鑒定。其他一些常用的分子標記則不具有16S rDNA基因的這種分類優勢[25]，因此，16S rDNA基因分析已成為微生物多樣性調查和分類鑒定中的主要技術。由此，本研究基于16S rDNA分析云南草地貪夜蛾擴散區與首發地種群腸道內細菌群落組成結構與多樣性及其差異，為進一步研究不同地區草地貪夜蛾種群生物學差異及腸道微生物調控其對生態適應性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試昆蟲為2019年6月20日分別從云南省普洱市江城縣寶藏鎮（22°41′10″N，101°38′30″E）、昆明市嵩明縣（25°15′52″N，102°56′24″E）采集的草地貪夜蛾4齡幼蟲。

1.2 腸道解剖

從兩個取樣點各選擇健康的草地貪夜蛾4齡幼蟲30頭，饑餓24 h，然后于75%乙醇中表面消毒5 min，再用蒸餾水漂洗3次，在超凈工作臺上解剖，將解剖出的腸道內容物分別溶解于2 mL無菌水中[26]。每個地點設置3個樣本，每個樣本10頭蟲，共6個樣本。腸道解剖完成后在-20℃冰箱中保存備用。

1.3 腸道細菌總DNA提取

使用PowerSoil DNA Isolation kit提取腸道DNA。

1.4 PCR擴增腸道細菌的16S rDNA

16S rDNA的V3-V4區域作為擴增和測序的目的片段[27]，引物由北京百邁科生物科技有限公司設計。引物序列為：515F： 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R： 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR體系為（20 μL）：基因組DNA 50 ng±10 ng，上下游引物各0.6 μL，KOD FX Neo Buffer 10 μL，dNTPs（2 mmol/L each）4 μL，KOD FX Neo 0.4 μL，ddH2O補至20 μL。反應條件為：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，20個循環;72℃延伸7 min。PCR產物進行磁珠純化，樣品與磁珠按照1∶1.5混勻后進行磁珠片段篩選，最終用17 μL無菌水洗脫，再進行1次Solexa PCR，反應體系為（20 μL）：目的區域PCR純化產物5 μL，★MPPI-a（2 μmol/L）2.5 μL，★MPPI-b（2 μmol/L）2.5 μL，2×Q5 HF MM 10 μL。反應條件為：98℃預變性30 s;98℃變性10 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環;72℃延伸5 min[28]。PCR產物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳40 min，回收目的片段。

1.5 文庫構建及數據處理

基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序（paired-end）的方法，構建小片段文庫并進行測序。對原始數據進行拼接[29]，將拼接得到的序列進行質量過濾[30]，并去除嵌合體[31]，得到高質量的tags序列。數據分析主要使用R語言。

1.6 腸道微生物鑒定和多樣性分析

使用Usearch軟件（v 7.0）對tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva（細菌）和UNITE（真菌）分類學數據庫對OTU進行分類學注釋。利用QIIME（v 1.80）軟件計算Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數。Chao1指數、ACE指數反映樣品中群落豐富度，而Shannon指數反映群落的多樣性，Simpson指數反映群落中優勢種的集中程度，Chao1指數、ACE指數、Shannon指數越大，Simpson指數越小說明樣品中的物種越豐富多樣。使用R語言分析樣品內物種豐富度和多樣性信息[32]，并通過KEGG代謝途徑差異分析寶藏鎮和嵩明縣的草地貪夜蛾腸道細菌基因在不同代謝通路中的表達情況。

2 結果與分析

2.1 序列拼接和組裝

通過Illumina HiSeq測序后，6個樣品共獲各302 786條有效tags（表1），6個樣本共獲得20門39綱86目161科318屬344種細菌，在97%的相似度水平下聚類共獲得564個OTUs。其中寶藏鎮有141 653條有效tags，聚類共獲得465個OTUs，共注釋到細菌16門29綱60目102科178屬192種;嵩明縣有176 551條有效tags，聚類共獲得490個OTUs，共注釋到細菌15門27綱54目96科172屬184種。確定各樣品中的OTU數目以后，對各樣品中共有OTU數目進行分析，發現寶藏鎮與嵩明縣樣品之間共有的OTU數目為391個。

2.2 草地貪夜蛾腸道細菌多樣性及豐富度分析

從門的分類水平上看（圖1），首發地寶藏鎮和擴散區嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA基因序列均注釋到了梭桿菌門Fusobacteria、柔壁菌門Tenericutes、Epsilonbacteraeota、脫鐵桿菌門Deferribacteres、疣微菌門Verrucomicrobia、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、藍藻門Cyanobacteria、變形菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes等共20門。其中，寶藏鎮草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌共注釋到16門，豐度前10的門依次為厚壁菌門（35.09%）>疣微菌門（12.80%）>擬桿菌門（12.76%）>變形菌門（12.21%）>藍藻門（11.71）>脫鐵桿菌門（5.9%）>放線菌門（4.76%）>Epsilonbacteraeota（2.66%）>柔壁菌門（1.10%）>梭桿菌門（0.86%）;擴散區嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌的16S rDNA基因序列共注釋到15門，豐度前10的門依次為厚壁菌門（65.87%）>變形菌門（10.73%）>擬桿菌門（9.32%）>放線菌門（7.72%）>疣微菌門（3.29%）>藍藻門（1.22%）>脫鐵桿菌門（1.04%）>梭桿菌門（0.06%）>柔壁菌門（0.03%）>Epsilonbacteraeota（0.02%）。由此可以看出，在門的水平上，寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道內優勢細菌門組成不同，但二者的優勢菌門均包括厚壁菌門，不過該門在兩地的相對豐度差異較大，寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌中厚壁菌門的相對豐度分別為35.09%和65.87%。

從綱水平來看（圖2），寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌16S rDNA基因序列均注釋到了δ-變形菌綱Deltaproteobacteria、α-變形菌綱Alphaproteobacteria、疣微菌綱Verrucomicrobia、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、丹毒絲菌綱Erysipelotrichia、放線菌綱Actinobacteria、產氧光細菌綱Oxyphotobacteria、擬桿菌綱Bacteroidia、梭菌綱Clostridia、桿菌綱Bacilli等共計39綱。其中寶藏鎮草地貪夜蛾腸道細菌的16S rDNA基因序列共注釋到29綱，豐度前10的綱依次為梭菌綱（15.84%）>疣微菌綱（12.80%）>擬桿菌綱（12.76%）>產氧光細菌綱（11.69%）>桿菌綱（10.44%）>丹毒絲菌綱（8.73%）>δ-變形菌綱（5.71%）>γ-變形菌綱（4.84%）>放線菌綱（3.07%）>α-變形菌綱（1.66%）;嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌共注釋到27個綱，豐度前10的綱為：桿菌綱（48.07%）>丹毒絲菌綱（9.94%）>擬桿菌綱（9.32%）>梭菌綱（7.81%）>γ-變形菌綱（7.35%）>放線菌綱（7.21%）>疣微菌綱（3.28%）>δ-變形菌綱（2.05%）>α-變形菌綱（1.34%）>產氧光細菌綱（1.18%）。由此表明，首發地寶藏鎮草地貪夜蛾的腸道細菌優勢綱為梭菌綱Clostridia，豐度為15.84%;而擴散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌優勢綱為桿菌綱，豐度為48.07%。

從目水平來看（圖3），寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA基因序列均注釋到了棒狀菌目Corynebacteriales、脫硫弧菌目Desulfovibrionales、疣微菌目Verrucomirobiales、微球菌目Micrococcales、腸桿菌目Enterobacteriales、丹毒絲菌目Erysipelotrichales、Chloroplast、擬桿菌目Bacteroidales、梭菌目Clostridiales、乳桿菌目Lactobacillales等共計86目。其中寶藏鎮草地貪夜蛾腸道細菌的16S rDNA基因序列共注釋到60目，豐度前10的目依次為梭菌目（15.84%）>疣微菌目（12.80%）>擬桿菌目（11.69%）>Chloroplast（11.68%）>丹毒絲菌目（8.73%）>乳桿菌目（8.69%）>脫硫弧菌目（5.67%）>腸桿菌目（1.23%）>微球菌目（0.39%）>棒狀菌目（0.37%）;嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌共注釋到54個目，豐度前10的目依次為乳桿菌目（47.32%）>丹毒絲菌目（9.94%）>擬桿菌目（9.17%）>梭菌目（7.82%）>腸桿菌目（6.30%）>微球菌目（4.19%）>疣微菌目（3.29%）>脫硫弧菌目（2.00%）>棒狀菌目（1.97%）>Chloroplast（1.18%）。由此表明，首發地寶藏鎮草地貪夜蛾的腸道細菌優勢目為梭菌目，豐度為15.84%;擴散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌優勢目為乳桿菌目，豐度為47.32%。

從科水平來看（圖4），寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA基因序列均注釋到了擬桿菌科Bacteroidaceae、瘤胃菌科Ruminococcaceae、短桿菌科Brevibacteriaceae、艾克曼菌科Akkermansiaeae、鼠桿菌科Muribaculaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae、微球菌科Micrococcaceae、腸球菌科Enterococcaceae等共計161科。其中寶藏鎮草地貪夜蛾腸道細菌的16S rDNA基因序列共注釋到102科，豐度前10的科依次為艾克曼菌科（12.80%）>微球菌科（11.63%）>鼠桿菌科（9.41%）>丹毒絲菌科（8.73%）>毛螺菌科（8.21%）>瘤胃菌科（6.77%）>腸球菌科（1.31%）>腸桿菌科（1.23%）>擬桿菌科（0.21%）>短桿菌科（0.06%）;嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌共注釋到96個科，豐度前10的科為腸球菌科（46.99%）>丹毒絲菌科（9.94%）>腸桿菌科（6.30%）>毛螺菌科（5.34%）>鼠桿菌科（5.05%）>艾克曼菌科（3.29%）>短桿菌科（3.08%）>瘤胃菌科（1.99%）>擬桿菌科（1.25%）>微球菌科（1.02%）。由此表明，首發地寶藏鎮草地貪夜蛾的腸道細菌優勢科菌為艾克曼菌科，豐度為12.80%;擴散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道細菌優勢科菌為腸球菌科，豐度為46.99%。

從屬水平上看（圖5），寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA基因序列均注釋到了黏液桿菌屬Mucispirillum、異桿菌屬Allobaculum、ZOR0006、擬桿菌屬Bacteroides、短桿菌屬Brevibacterium、腸桿菌屬Enterobacter、艾克曼菌屬Akkermansia、Muribaculaceae科的一未知屬、節桿菌屬Arthrobacter、腸球菌屬Enterococcus等共計318屬。寶藏鎮草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌共注釋到178屬，豐度前10的屬依次為艾克曼菌屬（12.80%）>節桿菌屬（11.63%）>Muribaculaceae科的一未知屬（9.30%）>黏液桿菌屬（5.10%）>異桿菌屬（1.82%）>腸球菌屬（1.31%）>ZOR0006（0.40%）>擬桿菌屬（0.21%）>腸桿菌屬（0.14%）>短桿菌屬（0.05%）;嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道內細菌共注釋到172個屬，豐度前10的屬依次為腸球菌屬（46.99%）>腸桿菌屬（6.20%）>異桿菌屬（5.60%）>黏液桿菌屬（4.99%）>艾克曼菌屬（3.29%）>短桿菌屬（3.08%）>擬桿菌屬（1.25%）>Muribaculaceae科的一未知屬（1.04%）>節桿菌屬（1.02%）>ZOR0006（0.06%）。由此表明，首發地寶藏鎮的草地貪夜蛾腸道優勢屬菌為艾克曼菌屬，豐度為12.80%;擴散地嵩明縣的草地貪夜蛾腸道優勢屬菌為腸球菌屬，豐度為46.99%。

從種水平上看（圖6），寶藏鎮和嵩明縣草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA基因序列均注釋到了沙德勒氏黏菌Mucispirillum schaedleri、不可培養的異桿菌屬細菌uncultured Allobaculum bacterium、細菌ZOR006、不可培養的擬桿菌屬細菌uncultured Bacteroides bacterium、短桿菌NXYK Brevibacterium sp. NXYK、細菌HA01、不可培養的艾克曼菌屬細菌uncultured Akkermansia bacterium、不可培養的鼠桿菌科一未知屬細菌uncultured Muribaculaceae bacterium、煙草節桿菌Arthrobacter nicotianae以及細菌NLAE-zl-C485等344個種。寶藏鎮草地貪夜蛾4齡幼蟲腸道細菌共注釋到192個種，其中豐度前10的種依次為不可培養的艾克曼菌屬細菌（12.80%）>煙草節桿菌（11.63%）>鼠桿菌科一未知屬細菌（9.30%）>沙德勒氏黏菌（5.10%）>不可培養的異桿菌屬細菌（1.28%）>細菌NLAE-zl-C485（0.94%）>不可培養的擬桿菌屬細菌（0.16%）>細菌HA01（0.14%）>短桿菌NXYK（0.06%）>細菌ZOR006（0.04%）;嵩明縣草地貪夜蛾幼蟲腸道內細菌共注釋到184種，豐度前10的種依次為細菌NLAE-zl-C485（46.96%）>細菌HA01（6.20%）>不可培養的異桿菌屬細菌（5.60%）>鼠桿菌科一未知屬細菌（4.99%）>不可培養的艾克曼菌屬細菌（3.28%）>短桿菌NXYK（3.07%）>不可培養的擬桿菌屬細菌（1.25%）>沙德勒氏黏菌（1.04%）>煙草節桿菌（1.02%）>細菌ZOR006（0.06%）。由此表明，首發地寶藏鎮草地貪夜蛾腸道優勢菌為不可培養的艾克曼菌屬細菌，豐度為12.80%;擴散地嵩明縣草地貪夜蛾腸道優勢種為細菌NLAE-zl-C485，豐富度為46.96%。

2.3 草地貪夜蛾腸道細菌群落多樣性分析

由表2可知，草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌有較高的豐富度和多樣性，寶藏鎮和嵩明縣的草地貪夜蛾腸道細菌ACE指數分別為360.25和295.54，Chao1指數分別為370.54和305.42，Simpson指數分別為0.13和0.36，Shannon指數分別為3.46和2.26。寶藏鎮的草地貪夜蛾腸道細菌ACE指數、Chao1指數、Shannon指數均高于嵩明縣，說明寶藏鎮的草地貪夜蛾腸道細菌多樣性更高，而寶藏鎮的Simpson指數低于嵩明縣，說明寶藏鎮草地貪夜蛾腸道細菌的優勢種集中程度高于嵩明縣。

2.4 功能預測及分析

通過KEGG代謝途徑差異分析（圖7），無論是首發地寶藏鎮，還是擴散區的嵩明縣，草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌所富集到的代謝通路一致，主要富集到的代謝通路為信號傳導、膜運輸、整體組織構建、翻譯、氨基酸代謝、核苷酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、復制和修復、碳水化合物代謝。但在部分代謝通路中基因表達存在差異，從信號傳導、整體組織構建、翻譯、氨基酸代謝、核苷酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、復制和修復通路基因表達來看，首發地BZ601樣品中分離出的腸道細菌基因表達量高于擴散地Sm601樣品;而在膜運輸、碳水化合物代謝通路中，首發地BZ601樣品中分離出的腸道細菌基因表達量低于擴散地Sm601樣品。

3 討論

從當前報道的草地貪夜蛾腸道可培養細菌組成來看，各地存在一定差異，其中巴西草地貪夜蛾種群腸道分離獲得的細菌有腸球菌屬、代爾夫特菌屬、勒克氏菌屬、細桿菌屬、假單胞菌屬、節桿菌屬和葡萄球菌屬7屬[17]，美國草地貪夜蛾種群中分離的細菌有泛菌屬、腸桿菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬和克雷伯氏菌屬5屬[18]，我國重慶種群分離的腸道細菌有克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬5屬[19]，云南省蒙自地區的草地貪夜蛾幼蟲腸道分離到的細菌有克雷伯氏菌屬、腸球菌屬、沙雷氏菌屬和摩根菌屬4屬[22]。本研究通過16S rDNA和Illumina Hiseq技術研究發現云南省草地貪夜蛾首發地種群與擴散地種群腸道內細菌共計20門39綱86目161科318屬344種，腸道細菌種類顯著多于美國和巴西草地貪夜蛾的腸道微生物類群，也多于重慶和云南蒙自地區草地貪夜蛾腸道細菌類群，究其原因，可能是不同地域環境條件及寄主植物的差異造成，也有可能是不同區域內施用的農藥等化學物質不同造成，這些都值得進一步深入研究。從腸道細菌的優勢屬組成來看，本研究中首發地和擴散地草地貪夜蛾幼蟲腸道內細菌與唐運林的報道存在差異，產生差異的原因在于16S rDNA和Illumina Hiseq技術不僅可以獲得可以培養的細菌，還可以檢測到許多不可培養的細菌，相對于傳統的分離培養技術，16S rDNA和Illumina Hiseq技術能夠更加全面地揭示腸道微生物組成結構及多樣性。

從草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌類群組成來看，首發地與擴散地存在明顯差異，其中寶藏鎮草地貪夜蛾種群腸道內細菌隸屬于16門29綱60目102科178屬192種，嵩明縣種群腸道內細菌隸屬于15門27綱54目96科172屬184種。寶藏鎮和嵩明縣兩個地區草地貪夜蛾腸道細菌的優勢菌門均為厚壁菌門，但擴散地優勢菌門的相對豐度顯著高于首發地，而在其他分類水平上，兩個地方的菌群組成及優勢菌種都存在差異，其原因可能是由于草地貪夜蛾遷飛擴散進入另一個生態環境后，兩個地方的生態環境及作物組成結構不同。此外，本研究通過多個生物多樣性指數分析，發現寶藏鎮的草地貪夜蛾腸道細菌豐富度高于嵩明縣。由此可以看出，首發地寶藏鎮田間草地貪夜蛾腸道細菌種類較擴散地的嵩明縣豐富，原因可能是兩地不同的氣候環境或兩地點寄主食物有差異，還有待進一步探討。本研究也表明，云南草地貪夜蛾首發地和擴散地種群腸道中細菌豐度前10的細菌門主要有梭桿菌門、柔壁菌門、Epsilonbacteraeota、脫鐵桿菌門、疣微菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍藻門、變形菌門和厚壁菌門。同時，厚壁菌門細菌在稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）、棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hübner）、小菜蛾Plutella xylostella（Linnaeus）、家蠶Bombyx mori Linnaeus、斜紋夜蛾 S.litura （Fabricius）等昆蟲腸道內都被分離獲得[32-33]，說明厚壁菌門在昆蟲腸道內廣泛存在。此外，唐運林等運用傳統培養法研究發現重慶地區草地貪夜蛾的腸道細菌屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門[19]，這3個門的細菌在本研究的云南省草地貪夜蛾首發地和擴散地種群腸道中也存在，進一步表明16S rDNA和Illumina Hiseq技術可用于昆蟲腸道內可培養和不可培養細菌群落組成結構及多樣性分析。

昆蟲腸道細菌在昆蟲消化食物、抗逆和生殖調控中發揮著重要作用[18，34]。據報道，草地貪夜蛾腸道中存在著大量的可降解農藥的細菌[20]，而本研究中對于草地貪夜蛾腸道內具有降解農藥作用細菌還未做深入研究，這也將是下一步深入研究的重要內容。此外，本研究通過KEGG代謝途徑差異分析，發現在多數代謝通路中，寶藏鎮草地貪夜蛾腸道細菌的基因表達量高于嵩明縣，僅在膜運輸、碳水化合物代謝通路中，寶藏鎮低于嵩明縣。造成該差異的原因可能是由于寶藏鎮與嵩明縣地理位置及氣候差異，草地貪夜蛾為適應不同的環境產生了適應性變化。

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（責任編輯：田 喆）