一種基于RPA的番茄褪綠病毒檢測方法

宋建　薛俊　孫海波　王姝　金鳳媚

摘要 番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus （ToCV）引起番茄褪綠病毒病，給番茄生產造成嚴重危害。開發(fā)快速準確的檢測方法對該病害的防控具有重要意義。利用番茄褪綠病毒外殼蛋白（CP）基因序列，設計特異性引物，建立了ToCV的重組酶聚合酶等溫擴增（recombinase polymerase amplification， RPA）檢測方法，同時分析了該方法的靈敏度和特異性。結果表明，建立的ToCV-RPA方法在38℃恒溫下40 min可從ToCV陽性的番茄樣品中擴增出246 bp的特異性條帶。擴增時間短，對設備要求低，且與番茄其他病毒無交叉反應，特異性好，靈敏度可達到PCR方法的10倍，適用于ToCV的快速檢測。

關鍵詞 番茄; 番茄褪綠病毒; 重組酶聚合酶等溫擴增

中圖分類號： S 436.421.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019168

Detection of Tomato chlorotic virus based on RPA

SONG Jian， XUE Jun， SUN Haibo， WANG Shu， JIN Fengmei*

（Tianjin Agricultural Biotechnology Research Center， Tianjin 300192， China）

Abstract

Tomato chlorosis virus （ToCV） is the pathogen of tomato chlorosis virus disease， which causes serious damage to tomato production. It is important to develop rapid and accurate detection methods for the prevention and control of tomato chlorosis virus disease. Based on the CP gene sequence of ToCV， the specific primers were designed for the detection of virus via recombinase polymerase amplification （RPA）. The specificity and sensitivity of the method were evaluated. The result showed that 246 bp specific band from ToCV-positive tomato samples could be amplified by the established ToCV-RPA method. The reaction condition was 38℃ for 40 min. The method has advantages of short operation time， low equipment requirement， and good specificity and there was no cross-reaction with other tomato viruses. The sensitivity was 10 times higher than that of the PCR method. It was suitable for rapid detection of ToCV.

Key words

tomato; Tomato chlorosis virus; recombinase polymerase amplification （RPA）

番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）是一種由煙粉虱傳播的病毒，由其引起的番茄褪綠病毒病在我國迅速蔓延，且逐年加重。番茄褪綠病毒屬于長線形病毒科Closteroviridae毛線病毒屬Crinivirus[1]。ToCV可以侵染茄科、菊科、藜科、莧科、番杏科、夾竹桃科及白花丹科等科的多種植物[2]，其中以茄科寄主最多，如： 番茄[3]、甜椒[4]、馬鈴薯[5]等。被病毒侵染后植株下部葉片葉脈間慢慢褪綠或黃化，然后逐漸蔓延至上部葉片，葉脈逐漸變成深綠色，染病葉片增厚變脆，植株長勢也變弱，病癥與生理性缺素癥或營養(yǎng)元素缺乏相似[6]。目前，番茄褪綠病毒病已經成為我國番茄生產中一種毀滅性的病害，嚴重威脅著我國番茄產業(yè)的健康發(fā)展。

目前，檢測番茄褪綠病毒主要采用RT-PCR技術[7]，而血清學檢測方法應用得較少[8]。分子生物學檢測主要是通過病毒的核酸來檢測病毒，它比血清學方法靈敏度高，能檢測到更低數量級的病毒，特異性強、操作簡便、可用于大量樣品檢測。PCR技術目前已經成為一種廣泛采用的病毒檢測方法，但該技術對儀器的依賴度高，完成擴增過程需要精密的溫度循環(huán)儀器，加之成本高、耗時長，使其應用大多限制于條件完善的實驗室內，難以廣泛應用于現(xiàn)場檢測。

近年來，等溫核酸擴增技術的出現(xiàn)解決了PCR技術的局限性，該技術降低了對儀器的要求，縮短了反應時間，因而日益受到關注。重組酶聚合酶擴增技術（RPA）是一種等溫核酸擴增技術，可在常溫下進行反應，具有反應快、靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點。目前RPA技術在醫(yī)學病原物的快速診斷中得到了一些應用[9-10]，農業(yè)領域中主要用于轉基因作物的檢測[11-12]，用于植物病毒檢測的報道較少。番茄褪綠病毒病是近年來番茄上最嚴重的病害之一，準確、快速地檢測其病原對于病害防治至關重要。本研究建立了基于RPA檢測番茄褪綠病毒的方法，以期為基層單位提供一種簡便適用的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

感染番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）、番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）、番茄花葉病毒Tomato mosaic virus （ToMV）、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）、煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus （TMV）的番茄葉片采自天津市西青區(qū)第六埠溫室，陰性對照為脫毒番茄苗，樣品經PCR檢測和序列測定確認后-80℃凍干保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 的合成

采用植物總RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取番茄葉片的總RNA。用反轉錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit，TaKaRa）將提取的總RNA反轉錄合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

根據已發(fā)表的ToCV外殼蛋白（CP）基因的保守序列設計番茄褪綠病毒的RPA檢測引物（表1）。

1.2.3 RPA 反應

以1.2.1合成的cDNA為模板，利用設計的RPA引物進行擴增，以脫毒番茄苗葉片cDNA為陰性對照。RPA擴增體系（50 μL）： 向0.2 mL TwistAmp反應管（TwistAmp Basic kits，Twist）中加入Rehydration Buffer 29.5 μL，正、反向引物（終濃度為0.4 μmol/L）各2.5 μL，模板cDNA 3 μL，去離子水10 μL，最后再加入280 mmol/L醋酸鎂溶液2.5 μL。將RPA擴增體系混合充分后置于38℃的金屬浴上反應40 min。反應結束后，利用純化試劑盒（DNA Fragment Purification Kit， TaKaRa）對擴增產物進行回收純化。

1.2.4 常規(guī)PCR

PCR反應體系（25 μL）：cDNA 2.5 μL，10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、去離子水14 μL、10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL。反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min，反應結束后于4℃保存。

1.2.5 電泳

取RPA或PCR反應產物5 μL于1.2%瓊脂糖凝膠電泳20 min，然后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果。

2 結果與分析

2.1 引物的篩選

分別利用引物對F1/R1、F1/R2、F1/R3、F3/R1、F3/R3、F4/R1、F4/R2、F4/R3進行擴增，產物片段的大小分別為246、115、125、130、150、92、112、440 bp。從圖1中可以看出各對引物都擴增出目標片段，但F1/R2、F1/R3、F4/R1、F4/R2 4對引物的擴增產物不夠清晰，F(xiàn)4/R3除了擴增出目的條帶，還有非特異性條帶產生，而F3/R1、F3/R3在后續(xù)試驗中重復性不夠好，因此最終選定引物組合F1/R1作為檢測引物。

2.2 RPA檢測方法的靈敏度

將帶毒植株的cDNA進行10倍梯度稀釋，濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，按照1.2.3所示的反應體系進行RPA靈敏度試驗，同時參考已經報道的ToCV檢測引物CP-F/CP-R[13]（擴增產物長度為840 bp）進行PCR靈敏度試驗，比較兩種方法的檢測靈敏度。結果表明，RPA法的檢測靈敏度為1 ng/μL（圖2a），PCR法的檢測靈敏度為10 ng/μL（圖2b），RPA法的靈敏度要優(yōu)于PCR法。

2.3 RPA檢測方法的特異性

按照1.2.3的RPA反應體系，檢測番茄褪綠病毒、番茄黃化曲葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒共5種病毒的cDNA，同時以脫毒番茄苗的cDNA為陰性對照，評價所建立的RPA檢測方法的特異性。從圖3中可以看出只有感染番茄褪綠病毒的番茄葉片對應的RPA反應擴增出了目的條帶，感染其他種對照病毒的番茄葉片均未擴增出條帶，由此證明本試驗的RPA引物特異性高，可有效檢測番茄褪綠病毒。

3 討論

本研究建立了一種番茄褪綠病毒的RPA檢測方法，可以在38℃等溫條件并且在40 min內完成目標cDNA的快速擴增，可特異性檢測番茄褪綠病毒，其他4種植物病毒的檢測結果均為陰性，RPA法檢測番茄褪綠病毒的靈敏度優(yōu)于常規(guī)PCR法，縮短了反應時間，也不需要昂貴的儀器，可在簡易實驗室和田間完成快速檢測，為番茄褪綠病毒病的診斷和預警提供了一種高效簡便的技術方法，在植物病毒快速檢測方面具有一定的實踐意義。

RPA對引物有嚴格要求，用于擴增反應的引物一般由30～35個核苷酸組成，這種較長的引物與模板序列互補性好，使擴增獲得的產物特異性更高。RPA引物的設計沒有特殊的方法，只能通過篩選較好的引物進行下一步試驗。此外RPA對儀器設備的要求較低，不需要PCR儀，反應可以通過水浴鍋或小型金屬浴完成，如果配合瓊脂糖凝膠電泳或小型便攜式設備，短時間內即可獲得檢測結果，適合基層單位的快速檢測，具有廣泛的應用前景。

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（責任編輯：楊明麗）