杭白芷根發育過程中香豆素類成分主要積累部位及含量變化研究

李博園,韓 敏，張明英，陳 瑩

(1.陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046；2.西安怡康醫藥連鎖有限公司，陜西 西安 710000)

中藥白芷為傘形科(Umbelliferae)植物[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. ]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. var.formosana(Boiss. )Shan et Yuan]的干燥根，具祛風濕，活血排膿，生肌止痛等功效，是一味傳統中藥[1～2]。白芷藥用化學成分主要有香豆素類、揮發油類以及黃酮類，其中香豆素類中的歐前胡素及異歐前胡素是白芷質量的主要控制成分，具有鎮痛、解痙等作用[3～5]。目前對中藥白芷的研究多集中在藥理和化學成分[6～8]等方面，景汝勤等人研究了白芷根的組織分化[9]，但對其結構發育與藥用成分積累關系研究較少[10]。歐前胡素在紫外波長下呈藍色熒光，具有易溶于乙醇的性質[11]。因此，本研究以杭白芷根為研究對象，通過顯微鏡技術觀察根的解剖結構，結合組織化學定位法以及植物化學方法，研究根中香豆素類藥用成分的分布以及含量變化，旨在為進一步揭示杭白芷根的結構與藥用成分的積累關系，為評價藥材質量提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

杭白芷主根于2018年3-10月采自陜西中醫藥大學藥用植物園栽培植株。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片法 選擇不同時期生長正常健康的植株，將主根分割成0.5～1 cm長的小段，50%～70%乙醇FAA固定液固定一周、再進行脫水、包埋，之后切片，切片厚度8 ～10 μm，番紅-固綠復合染色，中性樹膠封藏，LEICA ICC50 W型顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 組織化學定位法 取新鮮杭白芷主根中部，切成0.3～5 cm數個小段。取其中1小段冰凍切片，厚度30 μm，稀甘油封片后置于Leica DMBL熒光顯微鏡下，紫外光激發，觀察并拍照。陰性對照:取1小段，置于70%乙醇FAA固定液中一周，再依次經過85%、95%、100%乙醇處理后，進行冰凍切片，切片厚度30 μm，于Leica DMBL熒光顯微鏡下觀察并拍照。陽性對照：取歐前胡素為陽性對照，配制歐前胡素標準品溶液，將其滴加在載玻片上，制作臨時裝片，于Leica DMBL熒光顯微鏡下觀察并拍照。重復實驗3次。

1.2.3 數據統計 分別測量不同月份的杭白芷主根直徑，統一測量位置為全長1/2處，再選取相對應位置FAA固定，按照“1.2.1”石蠟切片法進行切片染色，之后每個時期選取在同一倍數下的5個視野，進行分泌道數量的統計。

1.2.4 植物化學法 研究采用高效液相色譜法對杭白芷根中歐前胡素、異歐前胡素的含量進行提取測定[12]。

1.2.4.1 色譜條件與系統適應性實驗。色譜條件：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相：乙腈-水(65：35)；檢測波長：247 nm，流速：1.0 mL·min，柱溫：30℃。

1.2.4.2 對照品溶液及供試品溶液的制備。精密稱取歐前胡素1 mg，異歐前胡素0.6 mg，加流動相溶解并制成濃度分別為1 μg·mL-1和6μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液；取不同時期的杭白芷粉末(過3號篩)各1.000 g，精密稱定后置錐形瓶中，再加流動相40 mL，超聲30 min，靜置至室溫過濾，濾液轉移至50 mL容量瓶，加流動相定容，0.45 μm微孔濾膜過濾作為供試品溶液備用。

1.2.4.3 精密度實驗及穩定性實驗。取對照品溶液10 μL，進樣5次，根據峰面積計算得歐前胡素、異歐前胡素的RSD分別為1.42%和1.05%，儀器精密度良好；取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣，按上述色譜條件測定歐前素及異歐前胡素的峰面積，表明歐前胡素與異歐前胡素在24 h內基本穩定再根據測得的峰面積值計算RSD，RSD分別為1.37%和1.14%。

1.2.4.4 標準曲線的繪制。取對照品溶液，分別稀釋1、3、5、8、10倍，分次進樣，按上述色譜條件測定。結果歐前胡素在0.055 μg～0.555 μg范圍內線性關系良好；異歐前胡素在0.033 μg～0.33 μg范圍內線性關系良好。

1.2.4.5 樣品含量測定。分別取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述高效液相色譜(HPLC)條件測得峰面積，并計算歐前胡素和異歐前胡素的含量。

1.2.4.6 重復性及加樣回收率實驗。取9月份杭白芷，照“1.2.4.2”項下方法制備供試品溶液5份，按上述色譜條件測定，歐前胡素、異歐前胡素的平均含量分別為0.097%和0.022%，RSD為0.89%，1.07%，表明該方法重現性良好；取9月份杭白芷粉末(過3號篩)約0.5 g，稱定，分別加入已知濃度的對照品適量，照“1.2.4.2”項下方法制備供試品溶液后，各取10 μL注入液相色譜儀，測定，計算歐前胡素的平均加樣回收率為99.4%，RSD為0.42%；異歐前胡素的平均加樣回收率為98.9%，RSD為0.89%。

2 結果

2.1 根的結構發育特征

杭白芷根的次生結構由外向內依次包括周皮、形成層、次生韌皮部、次生木質部(圖版Ⅰ，1)。次生結構開始形成以后，中柱鞘細胞不斷分裂形成木栓形成層，木栓形成層進一步分裂，向內產生栓內層細胞，向外產生木栓層細胞，木栓形成層細胞較小且排列緊密，栓內層為排列較疏松單層薄壁細胞，木栓層細胞一般由5～8層，呈磚形、排列整齊的細胞構成(圖版Ⅰ，2～3)。在木栓形成層形成早期，表皮細胞和初生皮層仍可見，之后隨著周皮的產生和次生維管組織的增加逐漸脫落，周皮由木栓層、木栓形成層和栓內層細胞共同組成(圖版Ⅰ，4)。周皮內側為皮層薄壁細胞，其細胞近圓形，排列較疏松，有細胞間隙，皮層內可見體積較大的橢圓形分泌道分布，其次向內是次生韌皮部(圖版Ⅰ，5)，最內側為次生木質部(圖版Ⅰ，6)。次生韌皮部由大量韌皮薄壁細胞和少量的篩管、伴胞組成，次生韌皮部中也可見數個類橢圓形的分泌道大致呈輪傘狀分布，導管、木纖維、薄壁細胞、木射線等共同組成次生木質部(圖版Ⅰ，7)，在次生木質部中，有大量的木薄壁組織細胞(圖版Ⅰ，5～7)。維管射線由次生韌皮部橫向發育出韌皮射線和次生木質部的木射線二者共同組成(圖版Ⅰ，8)。

2.2 組織化學定位

熒光顯微鏡下觀察杭白芷橫切面可以看出，在紫外光激發下，導管及周皮有熒光現象，香豆素類的積累部位分泌道也有較明顯的熒光出現(圖版Ⅰ，9)，而其他部位無熒光出現，陰性對照除周皮和導管以外，其他部位無熒光，分泌道熒光消失(圖版Ⅰ，10)，歐前胡素標準品的陽性對照中，歐前胡素發出的熒光與分泌道熒光一致(圖版Ⅰ，11)。

2.3 統計結果

對不同時期杭白芷主根及根中分泌道進行觀察，并統計了主根直徑大小以及分泌道的數量。在表1中可以看出，整個發育過程中，根直徑大小以及分泌道數量隨著月份逐漸增長，9-10月后增長趨于平穩。

表1 杭白芷根直徑大小以及分泌道數量統計結果

2.4 含量測定結果

以歐前胡素、異歐前胡素為評價指標(圖1為對照品HPLC圖，圖2為樣品HPLC圖)，分別測得不同時期杭白芷根中藥用成分的含量。圖3為不同時期杭白芷根中歐前胡素含量積累的動態過程，可以看出杭白芷根中的歐前胡素含量在3-5月份先緩慢增加后下降至全年最低為0.127%，而后在5-7月逐漸上升，7-8月又出現回落，在8-9月迅速上升，達到全年最高為0.692%，之后又出現下降；圖4為異歐前胡素含量積累的動態過程，異歐前胡素含量總體相比歐前胡素較低，可以看出3-7月處于上升趨勢，7-8月出現下降，之后再逐漸增加；總含量為歐前胡素和異歐前胡素總和，在圖5總含量的動態變化中可以看到，基本和歐前胡素變化趨勢一致，在9月份達到全年最高為0.781%。

3 討論

大多數傘形科植物中普遍存在分泌組織[13]。杭白芷根、莖以及葉中均有分泌道的存在[14～15]，本研究主要觀察了根的解剖結構，次生結構主要由周皮、皮層、次生韌皮部、次生木質部所構成，在中柱鞘和次生韌皮部中可見分泌道分布其中[10]，中柱鞘薄壁組織中的分泌道體積較大，次生韌皮部中的分泌道較小，大致呈輪傘狀分布，在北柴胡和狹葉柴胡中也有類似的現象[16～17]。在對不同時期根直徑大小以及分泌道數量的統計結果中可以看出，隨著根直徑的增長，分泌道數量也逐漸增加，當根直徑大小趨于穩定，分泌道數量也趨于穩定，結合組織化學定位結果，表明分泌道是香豆素類藥用成分積累的主要部位，這與蘭志瓊等在白芷根中香豆素類成分的組織化學定位研究中表明，香豆素類成分主要分布于分泌組織內，結果基本一致[18～19]，因此分泌道的分布和數量可以作為評價杭白芷根中藥用成分香豆素類含量的重要指標之一。

進一步通過高效液相色譜法對不同時期杭白芷根中主要藥用成分歐前胡素以及異歐前胡素含量進行測定，結果表明，在杭白芷根的生長發育過程中，歐前胡素、異歐前胡素以及總含量呈”S”型曲線增長,在5-7月份歐前胡素和異歐前胡素處于明顯上升期，在7-8月盛花期可能導致地下部分生長緩慢，含量下降，在9月份歐前胡素以及總含量達到全年最高，而在9-10月份分泌道數量較多，增長趨勢平穩，因此進一步說明分泌道與香豆素類藥用成分含量積累呈正相關，與藥材質量關系緊密。