基于腫瘤公共數據庫分析TUFM基因在肺癌中的表達及預后意義＊

李素芬，王唯斯，楊 娜，梅 雯，孫美濤，余 敏，熊 偉

肺癌是所有惡性腫瘤中導致人類死亡最為常見的原因［1］。2018年，全球數據統計大概有180萬人因肺癌死亡，達到惡性腫瘤致死總數的18.4%［2］。因為肺癌通常在就診時就已經是晚期，手術切除的可行性受到很大限制，而全身性藥物治療的重點是控制癥狀和延長生存期［3］，但晚期肺癌患者的生存率仍然很低［4］。

哺乳動物的線粒體執行許多基本的細胞功能，包括血紅素和磷脂的生物合成、能量的產生、調節細胞的凋亡等［5］。隨著對線粒體研究的不斷深入，人們對參與哺乳動物線粒體蛋白質翻譯的蛋白質因子及其翻譯的基本過程認識逐漸清晰，線粒體翻譯延伸因子 Tu（mitochondrial translation elongation factor Tu，TUFM）作為線粒體蛋白質翻譯延長因子之一，參與線粒體翻譯的延長過程［6］。He等研究者把肺癌細胞A549中的TUFM基因敲低后，上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達升高，并促進肺癌細胞發生上皮-間質轉化（pithelial-mesenchymal transition，EMT），提示TUFM基因在肺癌組織中的表達水平和肺癌的進展密切相關［7］。筆者擬通過多種腫瘤公共數據庫分析探討TUFM基因在肺癌中的表達及其預后意義。

1 材料與方法

1.1數據來源Oncomine（https：//www.oncomine.org/）是包括715個數據集和86，733個樣本數的基因芯片數據庫，可以從數據中自動提取生物信息［8］。GCBI 數 據 庫 （https：//www.gcbi.com.cn/gclib/html/index）是一種可以在線設計分析流程、進行基因數據分析的數據庫，可以查找生物醫學文獻，輸入基因得到基因信息，找到基因樣本，以及清楚標出樣本類型［9］。 基因表達譜動態分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA） （http：//gepia.cancer-pku.cn/）可以對TCGA數據集和基因型組織表達（GTEx）數據集進行可視化分析［10］。 通過使用Oncomine數據庫、GCBI數據庫和GEPIA在線分析軟件分析TUFM基因在不同腫瘤之間的表達水平以及正常肺組織和肺癌組織中的表達差異。Kaplan-MeierPlotter 數 據 庫 （http：//kmplot.com/analysis/）是一個mRNA表達譜芯片的公共數據庫，包括54675個基因、10461個癌癥樣本，涉及乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌以及肝癌。通過Kaplan-Meier Plotter數據庫分析TUFM基因表達與肺癌患者預后的關系［11］。人類蛋白質圖譜（Human Protein Atlas，HPA）（https：//www.proteinatlas.org/）是一種開放獲取數據的程序，運用轉錄組學和蛋白質組學技術，分析得到基因在正常組織和腫瘤組織中的免疫組化圖像［12］。檢索HPA得到TUFM基因在正常肺組織和肺癌組織表達的免疫組化結果。

1.2數據庫檢索通過Oncomine數據庫檢索TUFM在肺癌和正常肺組織中的基因表達差異。Oncomine數據庫檢索分析TUFM基因的設定條件為：（1）“基因：TUFM”；（2）“分析類型： 腫瘤 vs. 非腫瘤”；（3）“腫瘤類型： 肺癌”；（4）“數據類型：mRNA”；（5）“樣本類型：臨床樣本”；（6）臨界值設定（P 值＜1E-4，fold change 2，gene rank=top10% ）。（7）其他為數據庫默認設定。檢索結束后，選擇TUFM基因與肺癌的相關研究進行比較。

使用GEPIA數據庫對肺腺癌和肺鱗癌數據集進行可視化分析，輸入TUFM基因名稱，然后選擇肺腺癌數據集LUAD、肺鱗癌數據集LUSC進行分析。

根據TCGA肺癌數據集中TUFM mRNA表達量的中位數分為高表達組和低表達組，利用Kaplan-Meier Plotter數據庫對TUFM mRNA高表達組和TUFM mRNA低表達組與肺癌患者生存預后信息進行分析，并分別繪制首次進展生存期（first-progression survival，FP）、 總生存期 （overall survival，OS）、復發后生存期（post-progression survival，PPS）生存函數曲線。設定條件為：（1）Cancer Type：Lung cancer； （2）Gene symbol：TUFM； （3）Splitpatients by：Auto select best cutoff； （4）Survival：FP、OS、PPS；（5）其他為數據庫默認設定。

使用人類蛋白質圖譜HPA，從正常肺組織和肺癌中的人蛋白質圖譜中提取了可用于臨床的免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）數據。 選擇了高表達和低表達模式驗證TUFM基因在肺癌組織中具有作為分子靶向治療基因的可能性。

1.3數據庫中的觀察指標通過Oncomine數據庫和GCBI數據庫觀察TUFM基因在常見腫瘤表達差異。使用Oncomine數據庫觀察TUFM基因與肺癌的相關研究數據并進行綜合分析。通過Oncomine數據庫、GCBI數據庫和GEPIA數據庫，觀察TUFM基因在正常肺組織和肺癌之間的表達差異。使用人類蛋白質圖譜HPA查看和分析TUFM基因在肺組織中的表達情況，以及 TUFM基因在肺癌組織中的表達情況，獲取免疫組化的預測結果圖像。此外，利用Kaplan-Meier Plotter數據庫觀察TUFM基因與肺癌患者各項生存預后指標（FP、OS和PPS）之間的關系。

1.4統計學分析由腫瘤公共數據庫分析得到所有統計分析結果，TUFM在正常肺組織和肺癌組織中的差異比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。利用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析TUFM基因與肺癌患者預后之間的關系，以Logrank P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUFM基因在人體常見腫瘤中的表達Oncomine數據庫在線檢索后發現，該數據庫共收集了946項TUFM基因針對不同腫瘤類型的研究結果，其中關于TUFM基因表達有統計學差異的研究結果共113項。其中TUFM基因表達在常見腫瘤中升高的研究有35項。從GCBI數據庫中可以看到，TUFM基因在肺鱗癌、肺腺癌、子宮內膜癌、乳腺癌、結直腸癌等多種常見腫瘤中的表達量均高于正常組織，見圖1。GCBI數據庫分析結果發現，肺鱗癌組織與正常肺組織相比：TUFM基因在正常肺組織中平均表達值是2843.9，癌組織是4456.47，提示TUFM基因在肺鱗癌中高表達，見圖1A。肺腺癌組織與正常肺組織相比：TUFM基因在正常肺組織中平均表達值是2977.3，癌組織是4399.76，提示TUFM基因在肺腺癌中高表達，見圖1B。

2.2 TUFM在肺癌組織及正常肺組織的表達差異通過Oncomine數據庫分析發現，2001年—2012年共有19項研究涉及TUFM基因在正常肺組織和肺癌組織中的表達。TUFM基因在肺癌所有差異表達基因中的排名中位數為2753.0（P=0.044），且TUFM基因在肺癌中高表達，見圖2。對Oncomine數據庫中不同類型肺癌芯片分析結果發現，與正常肺組織相比，肺鱗癌、肺腺癌、大細胞肺癌以及小細胞肺癌組織中的TUFM基因均呈現高表達（P＜0.05），見圖3。使用GEPIA數據庫分別對肺腺癌和肺鱗癌數據集進行可視化分析，結果發現，正常肺組織（n=338）和肺鱗癌組織（n=486）相比，肺鱗癌組織中TUFM mRNA表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖 4A。 相較于正常肺組織（n=347），肺腺癌（n=483）中TUFM mRNA表達水平也顯著升高（P＜0.05），見圖 4B。

2.3人類蛋白質圖譜數據庫查找正常肺組織及肺癌組織的IHC結果從人類蛋白質圖譜數據庫（HPA）提取了TUFM在正常肺組織和肺癌組織中特征化的IHC圖像。正常肺組織與肺癌組織TUFM蛋白質陽性染色均定位于細胞質。正常的肺組織TUFM基因陽性染色不均勻，在巨噬細胞的細胞質呈強陽性，在正常肺細胞的細胞質內是弱陽性，兩種陽性染色混合存在，見圖5A。在肺癌組織中，TUFM基因在不同的腫瘤細胞組織的細胞質呈染色強陽性或弱陽性，見圖5B，圖5C。在正常肺組織和肺癌組織中TUFM基因陽性染色均存在明顯的區別。

2.4肺癌患者TUFM基因的表達水平與預后的關系檢索Kaplan-Meier Plotter數據庫，低表達TUFM基因肺癌患者的生存預后較差。TUFM高表達組肺癌患者的FP、OS和PPS均顯著優于低表達組，見圖6。在FP中，TUFM mRNA高表達組患者的中位生存時間明顯高于TUFM mRNA低表達患者（34.53月vs.11.17月）。在OS中，TUFM mRNA高表達組患者的中位生存時間明顯高于TUFM mRNA低表達組 （108.97月vs.45.27月）。在PPS中，TUFM mRNA高表達組患者的中位生存時間也明顯高于TUFM mRNA低表達組（20.20月vs.8.98月）。

圖6見封三。

圖6 肺癌中TUFM基因的表達水平與生存預后之間的關系

3 討論

TUFM蛋白在線粒體基因編碼的蛋白質翻譯過程中參與氨基酸延伸、密碼子-反密碼子互補配對以及校正氨基酸-tRNA配對［13］。TUFM蛋白可以正確識別氨基酰-tRNA并將其與GTP復合物共同轉運至核蛋白體完成轉位［14］，若氨基酰-tRNA能迅速與反密碼子-密碼子互補配對結合，則進入A位，若氨基酰-tRNA不能進行堿基互補配對，則從A位解離［15］。TUFM不僅對于線粒體蛋白質翻譯的保真度非常重要，也是參與線粒體蛋白質折疊的分子伴侶［16］。He等研究證明，在肺癌細胞中敲低TUFM基因時，肺癌細胞線粒體基因編碼蛋白的表達受到抑制，導致線粒體功能遭到破壞，ROS生成增加［7］。敲低TUFM基因可促進體外培養的A549細胞和小鼠體內肺癌發生EMT過程，導致腫瘤遷移和侵襲［7］。在肺癌患者中，發生EMT的肺癌患者呈現TUFM低表達，因此，低表達的TUFM基因可降低肺癌患者預后。而TUFM高表達組的肺癌患者可能還未出現遷移和侵襲，因此患者的預后比低表達組好。然而，TUFM基因導致肺癌發生發展的具體分子機制仍不清楚，有待于進一步探討。

圖1 GCBI數據庫中TUFM基因在正常組織和人體各腫瘤組織中的表達

圖2 Oncomine數據庫中19項TUFM基因在肺癌組織表達水平的研究

圖3 Oncomine數據庫中TUFM基因在肺癌及正常肺組織中的表達

圖4 GEPIA數據庫中TUFM mRNA在肺癌組織與正常肺組織之間的相對表達

圖5 正常肺組織及肺癌組織的IHC結果

使用Oncomine數據庫、GCBI數據庫、GEPIA數據庫、HPA數據庫以及Kaplan-Meier Plotter對TUFM基因在肺癌組織中的表達情況進行了整合的生物信息學分析。結果顯示，與正常肺組織相比，TUFM mRNA在各種類型的肺癌組織中均高表達（P＜0.05）。TUFM基因在包括肺鱗癌和肺腺癌在內的多種人類常見腫瘤中的表達量均高于對應的正常組織。TUFM基因在正常的肺組織以及肺癌組織中IHC結果存在明顯差別。最后，TUFM基因高表達組肺癌患者的預后結果較低表達組良好，可能是由于高表達TUFM基因抑制肺癌的轉移和侵襲，因此，TUFM基因表達水平與肺癌患者的預后密切相關。最近，Xu等研究發現，泛素特異性肽酶5（Ubiquitin specific peptidase 5，USP5） 和TUFM 基因在原發性結直腸癌組織中均高表達，并且與患者的預后相關。過表達USP5基因促進了結直腸癌細胞的生長，USP5基因可使TUFM基因去泛素化，提高TUFM基因在結直腸癌細胞中的表達水平［17］。研究還發現TUFM基因表達下調可以降低結直腸癌細胞中USP5基因的水平，表明過表達的TUFM基因發揮負反饋作用以減少去泛素化，提高結直腸患者預后生存時間［17］。此外，有研究表明，在具有氧化磷酸化依賴性的彌漫性大B細胞淋巴瘤中，抑制TUFM基因可選擇性誘導細胞毒性［18］。

該文通過數據庫綜合分析發現，TUFM在肺癌組織中高表達，提示TUFM基因可能參與了肺癌的發生和發展過程，并提示TUFM基因可能成為肺癌治療干預的有效靶點。