miR-548c-5p靶向Notch通路增強胃癌SGC7901/VCR細胞對紫杉醇的敏感性

黃河 魏童

新疆醫科大學第五附屬醫院1胃腸外科，2 血管腫瘤介入科（烏魯木齊830054）

癌癥是全球死亡的主要原因之一。化療是治療癌癥的主要方法之一。癌細胞對化療的耐藥性仍然是臨床上治療癌癥的主要障礙［1］。近年來，越來越多的研究表明，microRNA 在腫瘤細胞的藥物敏感或耐受中發揮了重要作用，為深入了解腫瘤耐藥機制并尋找腫瘤治療的新靶點提供了新的思路［2-3］。據報道，miRNA 在多種腫瘤中的表達水平發生異常［4］，在腫瘤中發揮原癌基因或腫瘤抑制因子的功能，使miRNA 在腫瘤診斷、預后和治療中展現出了一定的潛力［5］。miR-548c-5p 在多種腫瘤細胞中表達下調，在肝癌、結直腸癌中發揮了抑癌基因的作用。目前，miR-548c-5p 在胃癌中的調控機制尚未見報道。本研究發現miR-548c-5p 在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR 中顯著下調，生物信息學分析表明Notch 通路是潛在靶點，需要進一步通過分子、細胞實驗證實miR-548c-5p 通過Notch通路參與胃癌細胞增殖、侵襲和耐藥的調控。本研究首次證實了miR-548c-5p參與Notch通路調控，與胃癌細胞的耐藥密切相關，這將為解決胃癌化療耐藥問題提供新的理論依據和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料SGC7901 細胞和SGC7901/VCR 細胞系均購自ATCC 公司；細胞培養試劑（DMEM 培養基、OPTI-MEM 培養基、胎牛血清和雙抗）購自Gibco 公司；miR-548c-5p mimics 和miR-NC 由廣州博銳合成；pcDNA3.1-Notch1 質粒載體、pLUC-3′-UTR-Notch1 和pLUC-突變3′-UTR 質粒載體由上海生工構建；Lipofectamin2000、TRIzol 試劑和逆轉錄酶（RevertAid Reverse Transcriptase）購自Thermo；2×SGExcel FastSYBR Mixture 和miRNA qPCR master mix 購自上海生工；紫杉醇購自sigma；Notch1 抗體、Hes1 抗體和β-actin 抗體均購自Abcam 公司。

1.2 細胞培養和細胞轉染SGC7901 細胞和SGC7901/VCR 細胞在含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中培養，培養條件為37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱。細胞接種于6 孔板中，當長至培養板底部的80%以上時，參考lipofectamine 的說明書，進行microRNA mimics 或質粒轉染。

1.3 TRIzol 法提取細胞總RNA采用PBS 緩沖液沖洗貼壁細胞2 次，向細胞加入500 μL TRIzol試劑，裂解細胞。將細胞裂解液轉移至1.5 mL EP管中，每管加入100 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上層水相，加入新的EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，去上清液。用70%的無水乙醇洗滌2次，4 ℃，7 000 r/min 離心5 min，去上清液，自然條件下，充分干燥。加入30～50 μL DEPC 水溶解，采用分光光度計（NanoDrop ND-1000，Thermo）檢測RNA 的吸光度，分析RNA 的純度及濃度，要求A260/A280＞2.0，A230/A260＞1.8。保存于-80 ℃冰箱。

1.4 qRT-PCR將RNA 逆轉錄為cDNA。microRNA 定量：按照miRNA qPCR master mix 說明書，配制qPCR 反應體系（10 μL 2 × miRNA qPCR master mix +0.5 μL 上游引物+0.5 μL 下游引物+1 μL cDNA，加入超純水補齊至20 μL），以U6 為內參；Notch1 和Hes1 定量：按照2 × SGExcel FastSYBR Mixture 說明書，配制qPCR 反應體系（25 μL 2 ×SGExcel FastSYBR Mixture+1 μL 上游引物+1 μL 下游引物+1 μL cDNA，加入超純水補齊至50 μL），以β-actin 作為內參。上機檢測（StepOnePlusTM實時熒光定量PCR 儀，美國ABI）。目的基因相對表達量變化根據2-ΔΔCT計算。

1.5 Western Blot采用RIPA緩沖液裂解細胞，提取總蛋白。樣品經SDS-PAGE 分離，轉移至PVDF膜上。以1∶100～1∶1 000稀釋后加入一抗。以兔IgGHRP 抗體為二抗。以β-actin 為內參。在Fluor Chem Systems 下（ProteinSimple）觀察結果，采用Alpha View Software 分析目標蛋白（Notch1 和Hes1）的相對表達量。

1.6 熒光素酶報告基因實驗接種SGC7901/VCR細胞至6 孔板，采用lipofectamine2000 共轉染1 μg質粒和miR-548c-5p mimics 或miR-NC。24 h 后，使用熒光素酶檢測試劑盒（Promega）進行熒光素酶活性檢測。

1.7 細胞增殖分析用含10%胎牛血清的培養基將SGC7901/VCR 細胞配成懸液，以每孔104 個細胞接種96孔板。5%CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底。培養3～5 d 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL繼續孵育4 h。在酶標儀上測定每孔光吸收值，繪制細胞生長曲線。

1.8 細胞侵襲檢測細胞侵襲使用Transwell 小室（康寧）進行。將無血清培養基中的1×105個細胞放入涂有基質膠的上室（BD Biosciences）。接下來，將含有10%胎牛血清的培養基添加到下室。孵育24 h 后，除去上層膜殘留的細胞，將侵襲通過膜的細胞進行固定，用甲醇固定，用0.1%結晶紫染色。在IX71 倒置顯微鏡（Olympus）下計數并成像。

1.9 統計學方法采用GraphPad Prism5 統計軟件進行分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 在SGC7901/VCR細胞中的表達首先，采用qRT-PCR分析miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 在SGC7901 細胞系和SGC7901/VCR 細胞中的表達變化，結果表明，miR-548c-5p 在SGC7901/VCR 細胞的表達顯著低于SGC7901細胞（P＜0.05）（圖1A），而Notch1和Hes1在SGC7901/VCR細胞中mRNA水平顯著高于SGC7901細胞（P＜0.05）（圖1B）。進一步Western blot 結果表明，Notch1 蛋白和Hes1 蛋白在SGC7901/VCR 細胞顯著升高（P＜0.05）（圖1C、D）。以上結果顯示，在SGC7901/VCR 細胞中，miR-548c-5p 與Notch 通路可能存在一定關聯。

圖1 miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 在SGC7901 和SGC7901/VCR 細胞中的表達Fig.1 Expression of miR-548c-5p，Notch1 and Hes1 in SGC7901 and SGC7901/VCR cells

2.2 Notch 通路是miR-548c-5p 的靶點將miR-548c-5p mimics 轉染SGC7901/VCR 細胞，轉染48 h后，采用qRT-PCR 分析miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 的表達變化，結果表明，與miR-NC 轉染組相比，miR-548c-5p 的表達顯著升高（P＜0.05）（圖2A）。Western blot 結果表明，與對照組相比，miR-548c-5p 轉染后，細胞中Notch1 和Hes1 在蛋白質水平上表達也顯著下降（P＜0.05）（圖2B、C）。熒光素酶檢測結果表明，miR-548c-5p可以顯著降低Notch1野生型3′-UTR 質粒的熒光素酶活性（P＜0.05）（圖2D）。以上結果證明，miR-548c-5p 可以通過直接結合于Notch1 的3′-UTR 序列，抑制Notch 信號通路。

2.3 miR-548c-5p 通過靶向Notch 通路抑制SGC 7901/VCR 細胞增殖和侵襲為了分析miR-548c-5p 和Notch 通路對SGC7901/VCR 細胞生物學行為的影響，通過lipofectamine2000 瞬時轉染細胞后，采用CCK-8 實驗分析細胞的增殖，采用Twanwell實驗分析細胞的侵襲。CCK-8 結果表明，在轉染后72 h，miR-548c-5p 可以顯著抑制細胞的增殖，而過表達Notch1 可以抵消miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞增殖的抑制作用（圖3A）。Twanswell 結果表明，miR-548c-5p 可以顯著抑制細胞的侵襲，同樣，過表達Notch1 可以逆轉miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞侵襲的抑制作用（圖3B）。以上結果表明，miR-548c-5p 可以抑制SGC7901/VCR 細胞的侵襲，Notch1 是miR-548c-5p 的一個重要靶點。

2.4 miR-548c-5p可以提高SGC7901/VCR 紫杉醇的敏感性CCK-8實驗結果表明，在轉染后的72 h，過表達miR-548c-5p 可以顯著抑制SGC7901/VCR細胞的增殖，而將紫杉醇與miR-548c-5p 聯合，進一步抑制了細胞增殖（圖4A）。Twanwell結果表明，紫杉醇與miR-548c-5p 聯合，對SGC7901/VCR 細胞侵襲的抑制作用最強（圖4B）。以上結果證實，miR-548c-5p聯合紫杉醇可以進一步抑制SGC7901/VCR 增殖和侵襲，miR-548c-5p 可以明顯提高SGC7901/VCR 對紫杉醇的敏感性。

圖2 過表達miR-548c-5p 下調Notch1 和Hes1Fig.2 Overexpression of miR-548c-5p downregulates Notch1and Hes1

圖3 miR-548c-5p 抑制SGC7901/VCR 細胞增殖、遷移和侵襲Fig.3 miR-548c-5p suppresses proliferation，migration and envision of SGC7901/VCR cells

圖4 miR-548c-5p 增強SGC7901/VCR 細胞對紫杉醇的敏感性Fig.4 miR-548c-5p enhances the sensitivity of SGC7901/VCR cells to paclitaxel（PTX）

3 討論

在全世界范圍內，胃癌是致死率最高的疾病之一［6］。盡管在過去的幾十年里，胃癌發病率和病死率普遍下降，胃癌仍是全球第二大癌癥死亡原因，占新診斷癌癥的10%左右。目前，胃癌的治療手段主要包括手術治療、化療和放療［7］。化療仍然是提高可切除和進展期胃癌患者的整體生存和生活質量的主要治療手段。對于晚期患者，化療干預被認為可以抑制腫瘤侵襲和轉移，延長病人的生存期。然而，在許多情況下，治療失敗是因為癌細胞的固有或者獲得性的多藥耐藥（MDR）［8］。當前，藥物耐受被認為是一個多因素參與的過程，主要機制包括降低水溶性藥物的攝取，增強DNA損傷的修復，抑制腫瘤細胞凋亡，改變藥物的代謝和增加化療藥物的能量依賴性泵出等［9-10］。然而，影響胃癌的藥物耐受的機制仍未完全闡明。因此，有必要深入了解胃癌細胞耐藥的分子機制。

miRNA 是內源性的非編碼RNA，可以在轉錄后水平調節基因的表達，并已被證明可以在不同的生物過程中發揮關鍵性作用，包括細胞凋亡、增殖、應激反應和代謝［11］。已有研究揭示，miRNA 與多種腫瘤細胞化療敏感性或抵抗，包括卵巢癌細胞和乳腺癌細胞［12-13］。然而，關于miRNA 在胃癌化療耐藥中的作用，目前的研究仍然較少。在最近的研究中發現，有一部分microRNA 在胃癌耐壓細胞系中SGC7901/VCR 細胞和親代細胞系SGC7901中發生差異性表達。例如，miRNA-106b 基因的染色體7q22 位點，而該位點在SGC7901/VCR 細胞中通常是缺失的。在SGC7901/VCR 細胞中，有研究發現miR-16 和miR-15b 發生下調，進一步研究發現，miR-15b 和miR-16 可直接調控BCL2 的表達，從而調節癌細胞對化療藥物誘導凋亡的敏感性［14］。有研究發現，miR-548c-5p 在CD90+HepG2 細 胞中呈低表達，轉染miR-548c-5p 可以下調凋亡蛋白（bcl-2、bcl-XL 和caspase-3）的表達，并可以抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡［15］。本研究發現miR-548c-5p在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR 中的表達明顯下調，過表達miR-548c-5p 降低Notch1 和Hes1 的表達水平。

Notch 通路是多種腫瘤微環境中最重要的通路之一。Notch 受體與其配體的結合導致蛋白水解并釋放Notch1 激活的胞內結構域，該結構域通常移位至細胞核內，并驅動多個靶蛋白的表達，如Hes/Hey 家族和c-Myc［16］。大量研究證實，Notch 通路與腫瘤細胞化療藥物耐受密切相關［17］。然而，Notch 信號通路在胃癌細胞耐藥中的作用尚不清楚。本研究發現，miR-548c-5p 在胃癌耐藥細胞株中的表達顯著降低，通過生物信息學分析發現，Notch 是其潛在的靶點；Notch1 信號通路關鍵分子Notch1和Hes1在耐藥細胞株中的表達也明顯低于普通胃癌細胞。另外，通過轉染miR-548c-5p mimics，分析SGC7901/VCR 細胞的細胞生物學行為，結果發現miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞的增殖和侵襲具有明顯的抑制作用，而過表達Notch1 可以抵消miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞的抑制作用。以上研究證實，miR-548c-5p 可以通過靶向Notch1 通路，參與胃癌細胞的增殖、侵襲和耐藥的調控。而將miR-548c-5p 與紫杉醇聯合使用，可以進一步抑制SGC7901/VCR 細胞的增殖和侵襲，表明miR-548c-5p 可以提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性，有望為提高胃癌化療療效提供新的靶點和策略。

總之，本研究發現，miR-548c-5p 在胃癌耐藥細胞株中表達發生下調，過表達miR-548c-5p 可以抑制胃癌耐藥細胞的增殖和侵襲，另外，miR-548c-5p可以顯著提高胃癌耐藥細胞對紫杉醇的敏感性，分析發現，Notch 通路可能是miR-548c-5p 的重要靶點。本研究將為提高胃癌對化療藥物敏感性提供新的實驗依據及新的靶點。當然，本研究也存在欠缺之處，首先miR-548c-5p 的作用可能是由其不同靶基因的表達綜合作用的結果，關于miR-548c-5p 在胃癌中的調控機制還需要進一步深入研究和闡釋；另外，本研究僅停留在細胞層面上，進一步將補充體內實驗并結合臨床樣本進行驗證。