TH1、TH17及其細胞因子與結核性胸膜炎胸膜粘連的相關性

李煒霞 趙芝煥 張家強 舒敬奎 吳錦濤 劉凌

昆明醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學二科（昆明650032）

結核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，TP）是結核的常見類型，往往合并胸膜粘連甚至胸廓塌陷等并發癥，影響患者長期肺功能和預后［1］。通過B 超、CT、X 片等檢查評估胸膜粘連狀態的精確性低［2］，僅能間接觀察到較為明顯的胸膜粘連；尚缺乏相應的臨床參數和生物標記物來評估TP 患者的胸膜粘連狀態，且鮮少有研究從局部免疫機制對胸膜粘連的TP 患者進行干預來改善預后［3-5］。因此，本研究結合不同胸膜粘連程度下TP 患者外周血及胸腔積液中TH1 和TH17 淋巴細胞比例及其相關細胞因子水平，從局部免疫水平探討它們之間的相關性，以期為TP 的個體化診療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料入選我院2017年6月至2019年6月住院的89例內科胸腔鏡檢查初次診斷為TP 的患者。其中，男52例，女37例，年齡16～83 歲。入選標準［6］：（1）內科胸腔鏡下取胸膜結節和（或）胸腔內纖維條索直接涂片找到抗酸桿菌；（2）內科胸腔鏡下胸膜活檢病理呈典型結核性肉芽腫改變。排除標準［6］：（1）合并肺部良性疾病者；（2）原發或繼發惡性胸腔積液者；（3）3個月內曾用過激素及免疫抑制劑者；（4）患者及其家屬拒絕接受或無法耐受檢查者；（5）血清抗HIV抗體陽性者。

據內科胸腔鏡下的胸膜粘連程度，結合先前已有研究［6-7］，進行分組：0 級，胸膜可見充血腫脹、散在小結節，但未見胸膜粘連；1 級，胸膜腔內可見1～3 條經牽拉即可分離的胸膜粘連帶；2 級，胸膜腔內1 個區域有3 條或3 條以上粘連帶，鈍性可分離，使整個胸膜腔可以暴露；3 級，內科胸腔鏡下胸膜腔每個區域均有散在的粘連帶，部分胸膜腔粘連不能暴露，分離胸膜粘連時出現胸膜出血或損傷；4 級，大部分胸膜腔由于粘連而閉合，僅能暴露小部分胸膜腔，分離粘連時可出現胸膜出血或損傷。其中，0 級為無胸膜粘連，1～2 級為輕度胸膜粘連，3～4 級為重度胸膜粘連。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器廣州RayBio公司的ELISA細胞因子IFN-γ和IL-17 測定試劑盒；美國Hyclone公司的1640 培養基以及PBS 緩沖液；美國Gibco公司的胎牛血清（FBS）；美國BD 公司的Th1 和Th17 細胞分型試劑盒；美國Beckman Coulter 公司的EPI-CS XL 型流式細胞儀。

1.2.2 標本采集符合入組條件經內科胸腔鏡下疑診為TP 者，術中采集所有患者外周血及胸水：（1）胸水標本2 份：分別為10 mL 和5 mL，前者經離心后留取上清存于-80 ℃冰箱，檢測細胞因子，后者抗凝管采集以測定TH1 和TH17 細胞比例。（2）外周靜脈血標本2 份：分別為5 mL 和3 mL，前者經離心后留取上清存于-80 ℃冰箱，檢測細胞因子，后者抗凝管采集測定TH1、TH17 和CD4+T 淋巴細胞的比例。

1.2.3 測定TH1 和TH17 細胞比例FicoII 密度梯度離心法用于從胸膜液中分離單核細胞（PBMC）。將分離到的PBMC 重懸于RPMI 1640 完全培養基中，將細胞濃度調整為2×106個/mL。將2 mL 細胞懸液轉移至12 孔板中，并在37℃5%CO2培養箱中將佛波酯（50 ng/mL）、離子霉素（1 μg/ mL）和高爾基體蛋白轉運抑制劑添加至培養液中，孵育5 h。遵循BD 試劑盒的說明進行流式抗體染色。收集PBMC，以250 g 離心10 min，將細胞用1 mL 預冷的BD 細胞固定緩沖液固定15 min，然后以250 g 離心10 min，然后用染色緩沖液洗滌兩次。將細胞重懸于1 mL Perm/wash Buffer中，并在室溫下孵育15 min以進行膜穿孔。離心細胞后，將其重懸于50 μL Perm/wash Buffer 中，添加20 μL 混合抗體以進行標記染色，并在室溫下于黑暗中孵育30 min。用1 mL Perm/wash Buffer 洗滌兩次后，將細胞重懸于染色緩沖液中，流式細胞儀檢測。

1.2.4 測定細胞因子應用ELISA 的方法來測定胸水和血清中INF-γ、IL-17 的水平。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0 統計學軟件來進行統計分析，計量資料服從正態分布用均數±標準差表示，同組對象胸水和外周血相關指標的比較用配對t檢驗；多組間的指標的比較用單因素方差分析，如果有差異用q檢驗兩兩比較。計數資料用χ2檢驗；用spearman 秩相關分析比較相關指標與0～4 級粘連分級之間的相關關系。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胸膜粘連分組在內科胸腔鏡直視下，89例TP 患者分組，其中11例無粘連，49例輕度粘連，29例重度粘連（表1）；其中49例輕度粘連患者中，21例為1 級粘連，28例為2 級粘連；29例重度粘連組中，17例為3 級粘連，12例為4 級粘連。

2.2 一般情況將各胸膜粘連分組患者的臨床參數包括年齡、CRP、PCT、出現癥狀到就診時間等進行單因素方差分析以及χ2檢驗，結果提示3 組患者相關臨床參數之間差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.3 CD4+T 淋巴細胞水平CD4+T 淋巴細胞比例在3 組TP 患者外周血及胸水中的比例差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

2.4 TH1 細胞比例和IFN-γ水平的比較3 組患者胸水中TH1 細胞比例和IFN-γ均高于外周血，差異有統計學意義（P＜0.05），但在外周血中的差異無統計學意義（P＞0.05，表2、3）。

2.5 TH17 細胞比例和IL-17 水平的比較3 組TP患者胸水中TH17 細胞比例和IL-17 的水平較外周血高，差異有統計學意義（P＜0.05）；輕-重度膜粘連組胸水中的TH17 細胞比例及IL-17 水平均較無粘連組高，差異有統計學意義（P＜0.05）；輕-重度粘連組胸水中TH17 細胞百分比和IL-17 水平差異無統計學意義（P＞0.05），并且它們在3 組患者外周血中的差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表1 3 組TP 患者的相關臨床參數比較Tab.1 Comparison of related clinical parameters of 3 groups of TP patients ±s

表1 3 組TP 患者的相關臨床參數比較Tab.1 Comparison of related clinical parameters of 3 groups of TP patients ±s

年齡（歲）性別（例）無粘連組（n=11）36.18±22.75輕度粘連組（n=49）40.20±21.89重度粘連組（n=29）40.28±22.82 F/χ2值0.16 0.16 P 值0.85 0.93男 女4 7 CRP（mg/L）PCT（ng/mL）就診時間（d）19.07±11.24 0.16±0.09 18.00±12.36 21 28 33.42±29.38 0.16±0.12 20.61±13.14 12 17 28.82±20.29 0.20±0.18 25.93±14.37 1.53 0.88 1.94 0.22 0.42 0.15

2.6 TH17/TH1比值比較輕-重度粘連組在胸水中TH17/TH1 比值較外周血之間的差異有統計學意義（P＜0.05），無粘連組TH17/TH1 比值在外周血和胸水差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 3 組TP 患者胸水和血清的淋巴細胞百分比比較Tab.2 Comparison of lymphocyte percentage between pleural effusion and serum in 3 groups of TP patients ±s

表2 3 組TP 患者胸水和血清的淋巴細胞百分比比較Tab.2 Comparison of lymphocyte percentage between pleural effusion and serum in 3 groups of TP patients ±s

注：*表示同一組別胸水和外周血相關指標比較，差異有統計學意義；a，對比無胸膜粘連組，差異有統計學意義；b，對比輕度胸膜粘連組，差異有統計學意義（P ＜0.05）

指標CD4+T 細胞（%）F 值1.28 0.34 P 值0.28 0.71 TH17 細胞（%）23.31 0.34＜0.01*0.71 TH1 細胞（%）11.31 0.49＜0.01*0.61 TH17/TH1 比值部位胸水外周血t 值P 值胸水外周血t 值P 值胸水外周血t 值P 值胸水外周血t 值P 值無粘連組50.23±12.85 51.02±14.09-0.32 0.76 2.25±0.68 1.24±0.81 0.15 0.10 24.84±2.18 21.30±3.68 3.94＜0.01*0.09±0.03 0.06±0.05 1.54 0.16輕度粘連組51.98±8.21 50.90±3.66 0.98 0.33 5.03±1.41a 1.53±0.62 15.80＜0.01*31.80±6.23a 20.25±3.42 12.59＜0.01*0.17±0.06a 0.09±0.04 8.11＜0.01*重度粘連組54.44±7.35 52.82±14.78 0.47 0.64 5.25±1.33a 1.34±0.71 13.50＜0.01*33.87±4.54ab 20.21±3.07 21.30＜0.01*0.16±0.07a 0.07±0.04 6.23＜0.01*7.34 2.71 0.01*0.72

表3 3 組TP 患者胸水和外周血中IFN-γ、IL-17 的水平比較Tab.3 Comparison of levels of IFN-γ and IL-17 in pleural effusion and peripheral blood of three groups of TP patients ±s

表3 3 組TP 患者胸水和外周血中IFN-γ、IL-17 的水平比較Tab.3 Comparison of levels of IFN-γ and IL-17 in pleural effusion and peripheral blood of three groups of TP patients ±s

注：*表示同一組別胸水和外周血相關指標比較，差異有統計學意義；a，對比無胸膜粘連組，差異有統計學意義；b，對比輕度胸膜粘連組，差異有統計學意義（P ＜0.05）

指標IL-17（pg/mL）F 值3.85 0.01 P 值0.03*0.98 IFN-γ（pg/mL）部位胸水外周血t 值P 值胸水外周血t 值P 值無粘連組62.52±13.34 31.73±15.92 4.75 0.01*309.45±52.20 163.41±27.30 10.39＜0.01*輕度粘連組83.30±15.95a 35.30±17.38 13.35＜0.01*549.29±98.47ab 168.74±17.40 28.09＜0.01*重度粘連組94.06±25.34a 40.67±18.36 11.30＜0.01*607.49±91.52ab 166.79±8.30 5.11＜0.01*11.13 0.15＜0.01*0.15

2.7 入組受試者胸水相關指標分析受試者胸水中TH1 細胞比例、TH17 細胞比例、TH17 比TH1 的值、IL-17 以及IFN-γ水平與0-4 級粘連分級之間呈正相關（P＜0.05，表4）。

表4 TP 患者胸水相關指標和0～4 級粘連分級的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of pleural effusion-related indexes and grades 0 to 4 of TP patients

3 討論

結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）抗原及其代謝產物累及胸膜，炎癥趨化同時促進成纖維細胞增殖、黏附，使胸膜毛細血管通透性增加，在促炎因素作用下，胸腔積液中滲出的纖維蛋白原轉化為纖維蛋白在胸膜腔沉積，形成胸膜粘連。本研究結果提示盡管TP 患者的起病情況以及臨床癥狀有所不同，但在相關臨床參數包括年齡、性別、感染相關蛋白（CRP、PCT）和起病至就診時間之間的差異無統計學意義，這與王學亮等［8］的研究結果一致。TP是以CD4+T淋巴細胞為主導的遲發型變態反應；入組TP 患者胸水與外周血中CD4+淋巴細胞比例之間水平相當，循環中的CD4+淋巴細胞可以遷移到感染部位轉化為高分泌IFN-γ的終末成熟細胞［9］，提供有效的局部免疫。

MTB 感染時，誘導CD4+T 淋巴細胞分化成不同的亞型；T-bet 轉錄因子（T-box expressed in T cells）可以誘導CD4+T 淋巴細胞分化為TH1，正向調節TH1 分化［10］，負調節TH2 和TH17 分化；TH1分泌IFN-γ，促進巨噬細胞活化、成熟、吞噬來介導免疫保護［11-12］，IFN-γ可協同T-bet 進一步誘導TH1的產生；同時IFN-γ通過抑制IL-17 促中性粒細胞聚集來發揮保護作用［13］；而持續產生IFN-γ會引起臨床癥狀加重，導致組織損傷［14］。TH17 是IL-17的主要來源，IL-17 在感染早期刺激中性粒細胞的產生、募集、活化［15］，來清除胞內外病原體［16］，誘導免疫保護。由此，本研究對它們在不同胸膜粘連程度TP 患者的外周血和胸水中的水平進行檢測，來分析它們與胸膜粘連之間的相關性。

本研究發現3 組TP 患者胸水中的TH1、TH17細胞比例及IFN-γ、IL-17 水平均高于外周血，這與杜榮輝等［17］的研究結果相符；而且它們的水平在3組患者的外周血中無明顯差異，表明患者感染MTB 后相應的淋巴細胞和炎癥介質優先向感染部位聚集，這與許多國內外報道一致。研究結果顯示輕、重度胸膜粘連的TP 患者的胸水中TH1 和TH17 細胞比例以及INF-γ、IL-17 在胸水中的水平均較無粘連組高，TH17 與TH1 比值在無粘連組胸水和外周血之間的差異無統計學意義，并且隨著粘連程度的加重TH1 細胞比例和INF-γ水平逐漸增加，這與筆者前期報道［6］相一致，也就是說TP 患者胸水中的TH1、TH17 細胞比例以及IFN-γ、IL-17水平與是否存在胸膜粘連有關；同時spearman 秩相關分析比較入組患者胸水中TH1 細胞比例以及IFN-γ的水平與0-4 級粘連分級之間的關系，表明它們之間呈正相關。

IL-17 又分為A-F 六種亞型，ESKANDARI-NASAB 等［18］研究表明IL-17A rs2275913 是一種抗結核的保護因子，但IL-17F rs763780 T/C 是結核病的危險因素。DEVALRAJU 等［19］研究提示IL-17 等細胞因子在TB 患者中的水平降低是HIV 患者易感結核的機制之一；使用特定疫苗（細菌蛋白）接種小鼠后發現，感染MTB 后IL-17 優先于IFN-γ產生抵達感染部位誘導免疫保護［20］；IL-17 有望作為結核疫苗新靶點［21］。本研究中，輕、重度粘連組的胸水中TH17 細胞比例及IL-17 水平差異不明顯，但進一步應用spearman 秩相關分析比較入組患者胸水中TH17 細胞比例以及IL-17 的水平與0-4 級粘連分級之間的關系，發現它們呈正相關，即胸水中TH17 細胞比例和IL-17 水平越高，粘連分級越高。

但目前對胸膜粘連程度的分組尚無統一評價方法，尚缺乏大數據研究來驗證胸膜粘連程度評價依據對TP 患者治療及預后的指導意義。本研究未能設立非結核對照組，未能從組織細胞水平對結果進行驗證；我們將繼續從局部炎癥細胞及其相關炎癥介質水平結合臨床深入研究TP 患者胸膜粘連的機制，以期尋找指導TP 患者個體化防治及預后的新靶點。