乳桿菌產X-脯氨酰-二肽酰基-氨肽酶活性對契達干酪抗氧化活性及品質的影響

趙銘琪，張秀秀，李曉東*，劉 璐*，張宏達，張宏偉，白 杰

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

干酪富含多種乳酸菌，除有些乳酸菌自身具有一定的功能外，其發酵代謝還會生成功能性脂類、γ-氨基酸和活性肽等生物活性物質[1]，其中活性肽是干酪主要的活性物質，由2～20 個氨基酸組成，是通過乳酸菌分泌的蛋白酶對干酪酪蛋白水解生成的，使干酪兼具營養與功能價值[2-5]。研究表明，抗氧化肽具有清除體內自由基的功能，能減輕自由基對機體的損傷，是一種理想的天然抗氧化劑[6]。抗氧化肽對紫外線引起的線粒體損傷和自由基誘導的脂質過氧化具有明顯的保護作用，此外，抗氧化肽的作用機理還包括給抗氧化酶提供氫、鰲合金屬離子等[7-8]。

在干酪成熟中后期，發酵劑乳球菌由于自溶或干酪體系pH值降低，缺少碳水化合物而使其菌數快速減少，但非發酵劑乳酸菌，尤其是含有豐富蛋白酶的乳桿菌，可降解蛋白生成滿足自身生長的氨基酸和肽類，逐漸成為優勢菌株，促進干酪抗氧化肽的產生[9]。這些乳桿菌細胞內含有脯氨酰亞氨基氨肽酶（Pep I）、廣譜性氨肽酶（Pep N、Pep C）、X-脯氨酰-二肽酰基-氨肽酶（X-prolyl-dipeptide acyl-aminopeptidase，Pep X）等肽酶。而只有Pep N、Pep C、Pep X與源自酪蛋白的抗氧化肽降解有關。其中Pep N、Pep C對包含堿基、疏水性/無電荷或N-末端含有芳香族氨基酸殘基的多肽具有特異性，Pep X能夠切割N-末端富含脯氨酸的多肽，具有脯氨酸忒性的水解活性，可釋放酪蛋白中含有脯氨酸的氨基酸序列。其他氨肽酶不能水解N-末端或者倒數第2位含有脯氨酸的多肽，而富含脯氨酸的β-酪蛋白又是潛在的抗氧化肽的來源，目前已發現有超過80%的β-酪蛋白抗氧化肽與脯氨酸相關[10]，因此，可推斷Pep X是干酪成熟過程中的關鍵蛋白酶。

近年來，關于氨肽酶對干酪成熟過程中糖酵解、蛋白水解程度、質地以及風味形成方面影響的研究很多，但Pep X與干酪抗氧化活性間的關系尚不明確。經過前期研究發現市售的契達干酪具有一定的抗氧化活性，但活性普遍偏低，自由基清除率僅為18%左右，作用效果不明顯[11-14]。因此，本研究以契達干酪為研究對象，選取干酪生產過程中常用的非發酵劑乳桿菌4 株（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌），利用紫外誘變的方法對菌株進行3 輪紫外誘變，誘變出Pep X活性不同的菌株，進行遺傳穩定性研究后，利用其制備干酪。在干酪成熟時期監測Pep X活性 及干酪的抗氧化活性，以明確研究Pep X活性對干酪抗氧化能力的影響并建立二者間的相關性。而后對干酪進行感官及質構分析，明確成熟過程中Pep X對干酪品質的影響，以期為干酪的開發與應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）1.0319、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）1.0911、植物乳桿菌（L.plantarum）1.0202、瑞士乳桿菌（L. helveticus）1.0612均來自東北農業大學乳品科學重點實驗室的菌種庫；商業發酵劑Lactococcus lactissubsp.lactis和L. lactissubsp.cremoris混合菌種凝乳酶Stamix 1150 北京漢森公司。

生牛乳取自完達山牧場；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰菲羅啉、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 天津市科密歐化學試劑開發中心；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉北京奧博星生物技術有限公司；對硝基苯胺 阿拉丁試劑上海有限公司；檸檬酸鈉、檸檬酸 天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計 上海雷磁科技有限公司；數顯恒溫水浴鍋常州朗越儀器制造有限公司；721可見分光光度計上海菁華儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與誘變

根據馬春麗等[15]的方法稍作改動，對4 株菌進行紫外誘變。取菌懸液于平板中，置于15 W紫外燈下照射，時間分別為20、40、60、80、100、120 s，且照射過程中須不斷攪拌。選取菌株進行菌落計數，并計算致死率。確定照射時間后，對菌株在此條件下誘變3 輪。

經過1、2、3 輪紫外誘變的L. plantarum、L. casei、L. helveticus、L. rhamnosus分別為：UV-P1、UV-P2、UVP3；UV-C1、UV-C2、UV-C3；UV-H1、UV-H2、UVH3；UV-R1、UV-R2、UV-R3。

1.3.2 Pep X活性的測定

1.3.2.1 乳桿菌Pep X的粗提

根據郭宇星等[16]的方法略作修改，將生長至活菌數為1.0×109CFU/mL的培養液取出后，4 500 r/min離心20 min，用pH 7.1的Tris-HCl緩沖液洗滌，重復此操作3 次，即可收集菌體。將收集到的菌體懸浮于Tris-HCl緩沖液中進行超聲破碎。超聲破碎后，4 ℃、4 500 r/min離心30 min，取上清液，即為所需酶液。

1.3.2.2 乳桿菌產PepX活性的測定

根據張爽[17]方法略作修改。取0.2 mL酶液，加入到0.05 mL 16.4 nmol/L底物甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽溶液中，37 ℃水浴60 min后，加入乙酸終止反應，并在410 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M以Tris-HCl緩沖液代替酶液進行同樣操作。Pep X活性定義為：在37 ℃時，每分鐘生成1 μmol對硝基苯胺為1 個活力單位。

1.3.3 契達干酪的制備

工藝流程：原料乳→過濾、巴氏殺菌（63 ℃，30 min）→冷卻（32 ℃）→添加發酵劑和非發酵劑乳桿菌→發酵（32 ℃，60 min）→調整酸度→加氯化鈣→添加凝乳酶→凝乳（32 ℃，90 min）→切割（1 cm3）→攪拌升溫至42 ℃（每3～5 min升高1 ℃）→保溫攪拌（30 min）→靜置→排乳清→凝乳堆砌（每15 min反轉堆積一次，反轉7 次）→加鹽→成型壓榨→包裝→成熟。

發酵劑添加量根據Liu Lu等[18]方法略作修改，具體如下：空白組僅添加商業發酵劑，且發酵劑添加量（質量分數，下同）為0.01%。各實驗組中發酵劑添加量均為0.005%，非發酵劑乳桿菌添加量均為12%（體積分數），分別記為：UV-C3組、L. casei組、UV-H3組、L. helveticus組、UV-R3組、L. rhamnosus組、UV-P3組、L. plantarum組。

1.3.4 干酪中PepX活性的測定

參照郭宇星等[16]的方法略作修改。取5 g樣品和磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）5 mL于研缽中研磨2 min，5 000 r/min離心30 min。取0.2 mL上清液加入1.6 mL Tris-HCl（pH 7.1）和0.2 mL 16.4 nmol/L甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽溶液，37 ℃水浴60 min，加入乙酸終止反應，并在410 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M以Tris-HCl緩沖液代替酶液進行同樣操作。

1.3.5 干酪抗氧化活性的測定

1.3.5.1 契達干酪提取液的制備

水溶性蛋白的提取在Bottesini等[19]方法基礎上略作修改。在干酪成熟過程中，每30 d進行一次蛋白質的提取。分別取干酪樣品10 g溶于100 mL水中，用勻漿機勻漿2 min（過濾、離心），取上清液重復3 次。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率的測定

參照Shen Yingbin等[20]方法并略作修改。將1 mL DPPH-甲醇溶液與5 mL 15 mg/mL樣品溶液混合，避光反應30 min后，在515 nm波長處測其吸光度As，用甲醇溶液調零，并用甲醇代替樣品進行同樣操作作為空白Ac。DPPH自由基清除率計算如式（1）所示：

1.3.5.3 羥自由基清除能力的測定

參考Liu Jun等[21]方法并略作修改，將1 mL 0.75 mmol/L菲啰啉溶液、1.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、1 mL 2 mg/mL樣品以及1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液混合，并向混合液中加入1 mL 0.01% H2O2溶液。37 ℃條件下水浴30 min，在531 nm波長處測定吸光度As。將水解產物換成同體積的蒸餾水作為對照Ac，將加入的H2O2換成相同體積的蒸餾水作為對照Ar。羥自由基清除率計算如式（2）所示：

1.3.5.4 還原能力的測定

根據Duh等[22]方法略作調整。取1 mL 15 mg/mL樣品，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL的10 mg/mL鐵氰化鉀溶液，50 ℃保溫20 min，快速冷卻，加入2.5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混勻后于3 000 r/min離心10 min。取1.5 mL上清液與0.2 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液反應10 min。以蒸餾水調零，在700 nm波長處測定其吸光度。

1.3.6 契達干酪的質構分析

參照Liu Lu等[9]的方法略作修改。用TA.XT plus型質構儀進行測定，測試前探頭下降速率為5 mm/s，測試時速率為1.0 mm/s，觸發點值為5 g，兩次下降間隔為5.0 s。

1.3.7 契達干酪的感官評價

根據Ahmed等[23]的方法進行感官評價。評價標準如表1所示。

表1 契達干酪感官評價Table 1 Criteria for of sensory evaluation of Cheddar cheese

1.4 數據統計分析

每組實驗重復3 次，數據統計分析采用Statistix 8.1軟件進行分析，利用Origin軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的誘變

2.1.1 紫外誘變時間的確定

圖1 紫外誘變時間對菌株致死率的影響Fig. 1 Effect of UV mutation time on lethality

如圖1所示，當誘變菌株的致死率達到80%～90%時，可得到變異程度較大的變異菌株[15]。以此為依據，選擇100 s為菌株的最佳誘變時間。

2.1.2 誘變前后菌株的Pep X活性

圖2 誘變前后菌株的Pep X活性變化Fig. 2 Activity of Pep X in strains before and after mutagenesis

以對硝基苯胺為標準物的標準曲線為y=5.965 5x+0.070 5，相關系數為0.999 5。如圖2所示，誘變可使菌株所產Pep X活性不同程度提升，經過3 輪誘變后，L. rhamnosus的Pep X活性最高，最大值為12.73 U/mL。

2.1.3 誘變菌株遺傳穩定性分析

表2 誘變菌株的傳代穩定性實驗結果Table 2 Genetic stability of mutant strains

如表2所示，比較誘變菌株的第1、5、10代，三者之間Pep X活性差異均不顯著（P＞0.05）。因此，經過紫外誘變后，菌株的遺傳性狀相對穩定，可作為非發酵劑乳桿菌用于后續的干酪制備。

2.2 契達干酪中Pep X活性

如圖3所示，隨著成熟時間的延長，在0～90 d內，干酪中Pep X活性均呈上升趨勢，且均在第90天時達到最大值，而后呈現下降趨勢。添加了非發酵劑乳桿菌的各組干酪中Pep X活性均高于空白組，且經過誘變后菌株所產的Pep X活性顯著高于未經誘變的菌株（P＜0.05）。此外，L. rhamnosus組、UV-R3組中的Pep X活性均高于其他組，其最大值分別為4.87、10.16 U/g（P＜0.05）。這是由于Pep X屬于胞內酶，干酪成熟過程中的微生物繁殖和代謝反應誘導了乳桿菌的自溶現象，使得Pep X活性不斷升高。到后期產生的酶減少，加上成熟過程中環境的變化，酶活性降低，導致酶活性整體趨勢有所下降。可推斷，在前90 d內，乳桿菌逐漸自溶，致使Pep X活性也達到最大值。這與宋雪梅[24]的研究結果相似。

圖3 契達干酪成熟過程中Pep X活性變化Fig. 3 Change in Pep X activity in Cheddar cheese during ripening

2.3 契達干酪活菌數

表3 契達干酪成熟過程中活菌數變化Table 3 Changes in viable cell count during the ripening process of Cheddar cheeeessee

由表3可知，隨著成熟時間的延長，干酪中非發酵劑乳桿菌活菌數顯著下降（P＜0.05）。而在成熟的第180天時，各非發酵劑乳桿菌組干酪活菌數仍在7.01（lg（CFU/g））以上，符合益生菌食品活菌數的要求。此外，不同非發酵劑乳桿菌制備的契達干酪活菌數無顯著性差異（P＞0.05）。得出非發酵劑乳桿菌活菌數對干酪抗氧化活性的影響可忽略不計。

2.4 契達干酪成熟過程中抗氧化性

2.4.1 契達干酪成熟過程中DPPH自由基清除率

如圖4所示，隨著成熟時間的延長，在前90 d，水溶性提取物的D P P H自由基清除率均顯著增加（P＜0.05），且均在第90天時達到最大值（除空白組外最大值均達到30%以上）而后緩慢下降，且在第150天開始趨于穩定。這是由于在成熟前期，酪蛋白在Pep X的作用下不斷降解，生成具有抗氧化活性的肽段，使得干酪抗氧化活性顯著提升。而在90 d后，由于Pep X活性有所下降，抗氧化肽生成速度減慢，且在發酵劑等作用下，又被分解成不具抗氧化活性的小肽甚至游離氨基酸，最終抗氧化肽的生成與分解會達到動態平衡的狀態，使抗氧化活性接近穩定的狀態[25]。

圖4 契達干酪成熟過程中DPPH自由基清除率Fig. 4 Change in DPPH radical scavenging rate during the ripening process of Cheddar cheese

此外，在整個成熟過程中，非發酵劑乳桿菌組的DPPH自由基清除率均顯著高于空白組（P＜0.05），且UV-R3組中的DPPH自由基清除率均顯著高于其他組（P＜0.05），為68.43%。這是由于添加PepX活性越高菌株，水解干酪中的酪蛋白能力越強，從而使得契達干酪水溶性提取物的DPPH自由基清除率越高。

2.4.2 契達干酪成熟過程中的羥自由基清除率

圖5 契達干酪羥自由基清除率Fig. 5 Change in hydroxyl radical scavenging rate during the ripening process of Cheddar cheese

如圖5所示，在成熟期的前90 d，契達干酪的羥自由基清除率均隨著時間的延長而顯著增加（P＜0.05），在第90天達到最大值，而后開始緩慢下降，在150 d開始趨于平穩。在成熟過程中，非發酵劑乳桿菌組的羥自由基清除率均顯著高于空白組（P＜0.05），誘變后非發酵劑乳桿菌組羥自由基其清除率顯著高于誘變前及空白組（P＜0.05）。此外，L. rhamnosus組、UV-R3組的羥自由基清除率均顯著高于其他組（P＜0.05），分別為33.73%、67.56%。這是因為添加了產Pep X活性高的菌株，其Pep X可水解更多的酪蛋白，生成具有抗氧化活性的肽段，可與羥自由基結合，抑制其與其他物質發生反應，從而反映出較高的抗氧化活性[26]。

2.4.3 契達干酪成熟過程中還原能力

圖6 契達干酪成熟過程中還原能力Fig. 6 Change in reducing power during the ripening process of Cheddar cheese

由圖6可知，隨著成熟時間的延長，契達干酪水溶性提取物的還原能力均呈現顯著上升趨勢，在第90天達到最大值，而后平緩下降至第150天時，達到穩定狀態。此外，非發酵劑乳桿菌組還原能力均顯著高于空白組，且添加了Pep X活性不同的非發酵劑乳桿菌后，其還原能力也存在著顯著差異（P＜0.05）。這是由于同一株非發酵劑乳桿菌，經過紫外誘變后，其Pep X活性顯著高于未經誘變的菌株，進而導致水解能力有所不同，最終還原能力之間也存在著顯著性差異。此外，L. rhamnosus組、UV-R3組還原能力顯著高于其他相應組分，其還原能力（OD值）的最大值分別為0.367 3、0.684 3。這是由于干酪水溶性提取物的還原能力與分子質量大小有關，相同情況下，分子質量越小其還原能力越強[27]，產Pep X活性較強的UV-P3組，其還原能力也隨之提高。

2.5 相關性分析

表4 添加UV-R3干酪中活菌數、Pep X活性和抗氧化性間的相關性分析Table 4 Correlation analysis between viable cell count, Pep X activity and antioxidant activity in cheese

為建立契達干酪的抗氧化活性與乳桿菌產的Pep X活性間的聯系，選取抗氧化活性最高的UV-R3組，對活菌數、Pep X活性和抗氧化性間的相關性進行分析。如表4所示，干酪的抗氧化活性（DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力、還原能力）與干酪的成熟時間極顯著相關（P＜0.01），說明Pep X活性可直接影響酪蛋白水解成抗氧化活性的肽，并最終影響干酪的抗氧化活性。

2.6 質構分析

由于在第90天時，干酪的抗氧化活性達到最大值，因此對成熟90 d后的干酪進行質構分析（表5）。膠凝性、凝聚性和咀嚼性無顯著性的變化?？瞻捉M干酪的硬度顯著高于非發酵劑乳桿菌組（P＜0.05），這是由于高活性Pep X菌株的加入加速了酪蛋白的水解度，使得酪蛋白原有的網狀結構被破壞，導致干酪的結構變得松散，最終硬度下降[28]。而空白組與非發酵劑乳桿菌組的膠黏性和咀嚼性并無顯著差異（P＞0.05）。加入高活性Pep X菌株的非發酵劑乳桿菌組干酪彈性顯著高于空白組（P＜0.05），而加入低活性Pep X菌株的非發酵劑乳桿菌組干酪彈性與空白組無顯著差異（P＞0.05）。這是由于Pep X屬于胞內蛋白酶，將大分子的肽段水解，產生更多的共價鍵，使得干酪的網絡結構破壞，形成更小的網狀結構，進而提升了干酪的彈性[28]。

表5 契達干酪成熟90 d后質構分析Table 5 Texture analysis of Cheddar cheese ripened for 3 to 6 months

2.7 感官分析

如表6所示，隨著成熟時間的延長，契達干酪的外觀變化不顯著，且風味評分均在120 d達到最大值，而后呈緩慢下降趨勢。此外，隨著成熟時間的延長，各組干酪的苦味得分均呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。非發酵劑乳桿菌組干酪苦味顯著高于空白組（P＜0.05），這是由于高活性的Pep X加速了酪蛋白水解，產生了苦味肽。

綜合成熟過程中契達干酪的感官質構分析及抗氧化活性情況，可推斷高活性Pep X的非發酵劑乳桿菌組可在成熟120 d食用，此時干酪抗氧化活性相對較高，感官及質構效果最佳[29-30]。

表6 契達干酪成熟90 d后感官分析Table 6 Sensory analysis of Cheddar cheese ripened for 3 to 6 months

3 結 論

利用誘變產生的高Pep X活性乳桿菌制備契達干酪，可以顯著增加干酪的抗氧化性。在成熟過程的前90 d，其抗氧化活性（DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力）隨著時間的延長而逐漸升高，在第90天達到最大值，而后略有下降，在150 d后趨于穩定，但120 d后干酪苦味感官評分顯著降低。UV-R3組的Pep X活性和抗氧化活性顯著高于其他組（P＜0.05）。由此，非發酵劑乳桿菌產Pep X活性與干酪的抗氧化活性間存在極顯著正相關（P＜0.01），且在成熟第120天時，苦味感較小且質構情況較好。