miR-519d-3p靶向KPNA2對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制

胡德獻 孫衍昶 馮基高 莫業和

(海南醫學院第二附屬醫院神經外科，海南 海口 570311)

膠質瘤是顱內腫瘤中常見惡性腫瘤之一，其主要臨床病理特征為發病率高、死亡率高及惡性程度高，現有醫療水平尚不可有效治療膠質瘤，治療后膠質瘤患者生存期短預后差〔1〕。因而從分子水平上分析膠質瘤發病機制對探尋新的診療方法及提高治療效果均具有重要現實意義。研究表明微小RNA(miR)-519d-3p(miR-519d-3p)在胰腺癌組織和細胞中表達顯著降低，miR-519d-3p過表達可抑制胰腺癌細胞增殖〔2〕。miR-519d-3p過表達可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲〔3〕。miR-519d-3p在胃癌組織中低表達，上調表達后可抑制胃癌細胞增殖和侵襲〔4〕。然而，miR-519d-3p在膠質瘤細胞中的表達及其可能作用機制尚未見報道。為進一步明確miR-519d-3p在膠質瘤發生及發展過程中的可能作用機制，通過靶基因預測軟件檢索發現核轉運蛋白α-2(KPNA2)可能是miR-519d-3p的靶基因，研究表明KPNA2在膠質瘤中表達升高，敲除KPNA2后可顯著減弱膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力，但關于KPNA2上游調控miRNA等基因研究相對較少〔5〕。研究報道指出KPNA2在食管鱗狀細胞癌組織和細胞中過表達，抑制KPNA2表達可抑制癌細胞的增殖和克隆形成能力〔6〕。沉默KPNA2表達能夠有效抑制膀胱癌細胞和舌鱗癌細胞的遷移和侵襲能力〔7,8〕。但miR-519d-3p在膠質瘤細胞中的表達及其對膠質瘤細胞增殖、遷移侵襲的影響，且miR-519d-3p是否通過調控KPNA2的表達影響膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究分析miR-519d-3p在膠質瘤細胞中的表達，通過miR-519d-3p過表達分析其對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響，并驗證miR-519d-3p是否可通過調控KPNA2表達而參與膠質瘤發生及發展過程，以期為膠質瘤靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 正常膠質細胞株SVGp12購自美國ATCC，人膠質瘤細胞株U251、U87、T98G均購自上海醫學科學院細胞所。杜氏改良培養基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；miR-519d-3p mimics及其陰性對照、miR-519d-3p抑制劑(anti-miR-519d-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；KPNA2 siRNA干擾質粒(si-KPNA2)及其陰性對照(si-NC)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；MTT檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Western印跡所用的二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國TIANGEN公司；兔抗人KPNA2多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自美國R&D Systems公司；實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司；鼠抗人CyclinD1、p21、p27一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔與山羊抗鼠IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人MMP-2、MMP-9、MMP-14一抗均購自美國Santa Cruz公司；Trizol試劑與RNA反轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；pmiroGLO質粒與雙熒光素酶報告系統均購自美國Promega公司；Mgteigel基質膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；電化學發光(ECL)試劑購自美國Bio-Rad公司；Transwell小室購自重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及分組 膠質瘤細胞株U251、U87、T98G與正常膠質細胞株SVGp12復蘇后接種于含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養基中，放置在37 ℃、5%CO2培養箱內培養，用胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養。收集對數生長期細胞進行實驗研究，調整細胞濃度后將膠質瘤U251細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板，待細胞生長融合度達到80%左右時進行轉染，參照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行轉染，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，實驗將膠質瘤U251細胞隨機分為miR-NC組(U251細胞中轉染無關序列RNA)、miR-519d-3p組(U251細胞中轉染miR-519d-3p mimics)，采用qRT-PCR法驗證轉染效率。轉染前1 d將培養基更換為不含血清的培養基，轉染6 h后棄舊培養基并更換為含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養基繼續培養24 h或48 h。為驗證miR-519d-3p與KPNA2的調控關系，將miR-519d-3p mimics、anti-miR-519d-3p及其各自陰性對照分別轉染入膠質瘤U251細胞，即分別為miR-NC組、miR-519d-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-519d-3p組。為證實miR-519d-3p是否通過調控KPNA2表達而發揮作用，本研究設置共轉染組，分別為miR-519d-3p+pcDNA組(miR-519d-3p mimics與pcDNA共轉染入膠質瘤U251細胞)、miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2組(miR-519d-3p mimics與pcDNA-KPNA2共轉染入膠質瘤U251細胞)，轉染條件與上述轉染相同，實驗過程中均需嚴格按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行操作，轉染6 h后更換為含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養基繼續培養24 h或48 h，收集對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中miR-519d-3p、KPNA2 mRNA表達水平 取膠質瘤細胞株、正常膠質細胞株及轉染后各組對數生長期的膠質瘤U251細胞，胰蛋白酶消化細胞后計數，吸取5×106個細胞，用預冷PBS洗滌細胞3次×5 min，加入1 ml Trizol試劑，室溫放置5 min后加入200 μl氯仿，放入渦旋振蕩器振蕩30 s，4℃條件下12 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清置于另一無菌無酶的1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇后放入渦旋振蕩器振蕩30 s，冰上放置5 min后，4℃條件下12 000 r/min轉速離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌離心管底的RNA沉淀，洗滌2次，將離心管置于超凈工作臺晾干，加入20～40 μl DEPC水溶解(根據RNA量多少而定)，經分光光度計測定RNA濃度，A260/A280在1.8～2.0之間為質量較好。根據RNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應體系為20 μl：SYBR PCR Master mix 10 μl，正反向引物各0.4 μl，cDNA模板2 μl，無RNase水7.2 μl。反應程序設定為95℃ 5 min循環1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環40次。反應結束后根據樣本閾值Ct值，取3個復孔的平均值為該樣本Ct值，計算△Ct值(目的基因Ct值與內參基因Ct值的差值)與△△Ct值(目的基因△Ct值與內參基因△Ct值的差值)，以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.3Western印跡檢測KPNA2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達 膠質瘤細胞株、正常膠質細胞株及轉染后各組對數生長期的膠質瘤U251細胞，加入RIPA裂解緩沖液(1 ml RIPA、1%PMSF、0.1%抑肽酶)提取細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，取蛋白樣本進行10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫下依次加入KPNA2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白一抗(稀釋倍數1∶1 000)，4℃條件下搖晃孵育24 h，TBST洗滌3次，加入IgG二抗(稀釋倍數1∶3 000)，將一抗反應膜放入二抗中，置于室溫下避光孵育1 h，滴加ECL顯影，暗室中曝光，凝膠分析系統及Quantity one軟件檢測條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.4細胞增殖實驗 MTT檢測細胞增殖的主要原理為：活細胞中琥珀酸脫氫酶可促使MTT分解而產生藍色結晶狀甲臜顆粒，其具有不溶于水的特性并可在細胞內及細胞周圍沉積，藍色顆粒數量與細胞活力呈正比，而二甲基亞砜(DMSO)又可溶解藍色顆粒物，通過酶標儀檢測OD值可確定細胞增殖速率。收集對數生長期膠質瘤U251細胞，用胰蛋白酶消化細胞制備單細胞懸液，以每孔2×103個細胞的密度接種于96孔板，100 μl/孔，每組均設置5個復孔，在轉染后第24、48、72小時各取一組細胞，每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml)，繼續培養4 h后棄培養液，分別在每孔加入150 μl的DMSO溶液，繼續培養2 h，選取波長為490 nm置于酶標儀檢測各孔OD值。

1.2.5Transwell小室細胞遷移及侵襲實驗 細胞遷移實驗：取轉染后各組對數生長期膠質瘤U251細胞，胰蛋白酶消化細胞后加入不含血清培養基制備單細胞懸液，調整細胞密度為2×105/ml，將Transwell小室置于24孔板內，上層加入100 μl單細胞懸液，下室加入含有10%FBS的DMEM培養基，置于溫度為37℃、5%CO2、相對濕度95%的培養箱內繼續培養8 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去微孔膜上層細胞，用4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色5 min，置于光學顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察并計數。細胞侵襲實驗：無血清DMEM培養基與基質膠以1∶8稀釋比進行稀釋，將100 μl基質膠稀釋液平鋪于Transwell小室底部的上室面，室溫放置6 h后，將100 μl單細胞懸液加入Transwell小室的上室，細胞繼續培養24 h，其余步驟與細胞遷移實驗相同，實驗均設置3次重復，取平均值表示實驗結果。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 應用靶基因軟件預測miR-519d-3p的靶基因，發現KPNA2基因可能為miR-519d-3p潛在的靶基因。預測miR-519d-3p調控KPNA2基因的結合序列，設計合成KPNA2的3′UTR序列與突變后KPNA2的3′UTR序列，將合成的目的基因片段分別克隆入雙熒光素酶報告基因字啊提，構建KPNA2的3′UTR雙熒光素酶報告基因野生型載體(WT-KPNA2)及其突變型載體(MUT-KPNA2)。用PCR電泳及基因測序等技術鑒定證明重組載體構建成功。參照Lipofectamine2000轉染試劑分別將WT-KPNA2、MUT-KPNA2與miR-519d-3p mimics或miR-519d-3p的陰性對照(NC)共轉染入膠質瘤U251細胞，利用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測其熒光素酶活性。

2 結 果

2.1miR-519d-3p和KPNA2在膠質瘤細胞和正常膠質細胞中的表達 與正常膠質細胞株SVGp12比較，膠質瘤細胞株U251、U87、T98G中miR-519d-3p的表達水平均顯著降低(P<0.05)，而KPNA2 mRNA的表達水平均顯著升高(P<0.05)，其中膠質瘤U251細胞中miR-519d-3p的表達水平較其他膠質瘤細胞株相對降低，而KPNA2 mRNA的表達水平相對升高，因此后續研究選用膠質瘤U251細胞為研究細胞。相較于正常膠質細胞株SVGp12，膠質瘤細胞株U251、U87、T98G中KPNA2的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 KPNA2蛋白表達

表1 miR-519d-3p和KPNA2在膠質瘤細胞和正常膠質細胞中的表達

2.2miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞U251增殖的影響 轉染miR-519d-3p mimics的膠質瘤U251細胞中miR-519d-3p的表達水平顯著高于轉染陰性對照序列的miR-NC組(P<0.05)，提示成功升高膠質瘤U251細胞中miR-519d-3p的表達水平，見表2。轉染miR-519d-3p mimics的膠質瘤U251細胞在轉染后48 h、72 h后OD值顯著高于miR-NC組(P<0.05)，表明miR-519d-3p過表達可顯著抑制膠質瘤細胞增殖。相較于miR-NC組，miR-519d-3p組膠質瘤U251細胞中CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，表明miR-519d-3p過表達可通過上調p21、p27蛋白表達及下調CyclinD1蛋白表達進而抑制膠質瘤細胞增殖，見圖2，表2。

圖2 增殖相關蛋白表達

表2 miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞U251增殖的影響

2.3miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞U251遷移、侵襲的影響 miR-519d-3p組膠質瘤U251細胞遷移及侵襲數均顯著少于miR-NC組(P<0.05)，見表3，表明miR-519d-3p過表達可顯著降低膠質瘤細胞遷移及侵襲能力。miR-519d-3p組膠質瘤U251細胞中MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達水平較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，見表3，圖3、圖4。表明miR-519d-3p過表達可通過下調MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達進而抑制膠質瘤細胞遷移及侵襲。

表3 miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞U251遷移、侵襲的影響

圖3 兩組遷移侵襲相關蛋白表達

圖4 miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞U251遷移、侵襲的影響(×200)

2.4抑制KPNA2表達對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉染si-KPNA2的膠質瘤U251細胞中KPNA2的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5、表4，提示成功降低膠質瘤細胞中KPNA2的高表達。si-KPNA2組膠質瘤U251細胞增殖活性與si-NC組比較顯著降低(P<0.05)，遷移及侵襲細胞數與si-NC組比較均顯著減少(P<0.05)，表明抑制KPNA2表達可顯著抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲。與si-NC組比較，si-KPNA2組膠質瘤U251細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，而p21的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，表明抑制KPNA2表達可通過上調p21表達及下調CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達進而抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲。見圖5，表4。

圖5 KPNA2蛋白和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表4 抑制KPNA2表達對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5miR-519d-3p靶向調控KPNA2的表達 通過生物信息學分析發現KPNA2基因的3′UTR存在miR-519d-3p的結合位點，且結合穩定性較好，其互補結合序列見圖6A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，轉染克隆有KPNA2基因的3′UTR突變型載體質粒(MUT-KPNA2)中，共轉染miR-519d-3p mimics與轉染陰性對照(miR-NC)比較熒光素酶活性比較差異不顯著(P>0.05)；轉染克隆有KPNA2基因的3′UTR載體質粒(WT-KPNA2)中，共轉染miR-519d-3p mimics的熒光素酶活性較共轉染miR-NC的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表5。表明miR-519d-3p與KPNA2存在結合位點，并可調控KPNA2的活性。如圖6B所示，與miR-NC組(0.63±0.06)比較，miR-519d-3p組膠質瘤U251細胞中KPNA2的蛋白表達水平顯著降低(0.26±0.03，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.61±0.05)比較，anti-miR-519d-3p組膠質瘤U251細胞中KPNA2的蛋白表達水平顯著升高(0.92±0.09,P<0.05),表明miR-519d-3p可負向調控靶基因KPNA2的表達。

A:KPNA2的3′UTR中含有與miR-519d-3p互補的核苷酸序列；B：KPNA2蛋白表達,1～4:miR-NC組、miR-519d-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-519d-3p組圖6 miR-519d-3p靶向調控KPNA2的表達

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6KPNA2過表達逆轉了miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞U251增殖、遷移和侵襲的作用 如圖7、表6所示，相較于miR-519d-3p+pcDNA組，miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2組膠質瘤U251細胞OD值顯著增加，遷移及侵襲細胞數均顯著增多(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著升高，而p21的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。表明KPNA2過表達可部分逆轉miR-519d-3p過表達對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

1～4:miR-NC組、miR-519d-3p組、miR-519d-3p+pcDNA組、miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2組圖7 KPNA2蛋白和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表6 KPNA2過表達逆轉了miR-519d-3p過表達對U251增細胞殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

膠質瘤具有浸潤性生長等特點，臨床常采用手術及放療或放療等手段進行治療，但手術治療效果較差，因此深入探究膠質瘤發生及進展機制對尋找新治療方法具有重要意義〔9〕。miR是一類內源性非編碼小RNA分子，其可調節應激反應、細胞分化、增殖、侵襲及凋亡等多種生物學過程〔10〕。miR可通過與靶基因的結合而抑制靶基因翻譯進而抑制其表達，而靶基因又可調控細胞增殖及侵襲等生物學行為〔11〕。因此，深入探究miRNA及其靶基因在膠質瘤發生及發展過程中的作用機制對研發膠質瘤治療藥物具有重要指導意義。

miR-519d在喉鱗癌細胞中呈低表達，上調miR-519d表達可通過抑制轉錄激活子(STAT)3表達進而抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡〔12〕。miR-519d在胰腺癌細胞中表達水平降低并可促進胰腺癌細胞增殖及侵襲，提示上調miR-519d表達可能抑制胰腺癌細胞增殖及侵襲〔13〕。miR-519d表達水平升高可能通過抑制XIAP基因表達進而抑制卵巢癌細胞增殖最終抑制卵巢癌生長〔14〕。相關研究報道指出miR-519d-3p可抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡〔15〕。本研究結果說明miR-519d-3p在膠質瘤發生及發展過程中可能發揮抑癌基因作用，U251細胞過表達可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲。p21是CDK2抑制劑且可作為膠質瘤細胞周期相關的泛素-蛋白酶體通路靶蛋白，p27是細胞周期蛋白D-CDK4等的負性調節因子，通過抑制CyclinD1蛋白表達及促進p21、p27蛋白表達可誘導膠質瘤細胞周期停滯于G1期，抑制膠質瘤細胞增殖〔16,17〕。本研究結果提示miR-519d-3p 過表達后可通過促進p21、p27蛋白表達及抑制CyclinD1蛋白表達進而抑制膠質瘤細胞增殖。MMPs類是一種降解細胞外基質蛋白的酶，其中MMP-2、MMP-9、MMP-14是基質金屬蛋白酶中的重要酶類，期可通過降解血管周圍基膜中層黏連蛋白及纖連蛋白等進而促進腫瘤細胞向周圍組織浸潤導致細胞轉移及侵襲〔18,19〕。本研究結果提示miR-519d-3過表達后可通過抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達進而抑制膠質瘤細胞遷移及侵襲。KPNA2位于人染色體17q23-q24，可參與細胞分化、免疫反應及細胞增殖凋亡等多種生理病理過程，近來研究發現KPNA2可參與腫瘤發生及發展過程〔20〕。乳腺癌細胞中KPNA2表達水平升高并可促進腫瘤細胞增殖及遷移，沉默KPNA2表達后乳腺癌細胞增殖能力明顯降低〔21〕。表明KPNA2高表達可促進乳腺癌細胞惡性轉化進程進而促進乳腺癌發生及發展。進一步研究發現敲低KPNA2表達可通過上調E-cadherin表達及下調Vimentin表達而抑制EMT轉化進程進而抑制卵巢癌細胞遷移及侵襲，同時在體內實驗證明微小RNA-26b(microRNA-26b，miR-26b)可通過抑制KPNA2表達進而抑制卵巢癌生長〔22〕。相關研究表明原發性腸癌組織中KPNA2的表達水平顯著高于癌旁組織，KPNA2高表達于結腸癌患者高分化程度、發生淋巴結轉移等呈明顯正相關，并可作為結腸癌患者預后的獨立預測因子，同時在裸鼠移植瘤中敲低KPNA2表達可明顯抑制腫瘤細胞增殖及克隆形成能力〔23〕。本研究結果說明抑制KPNA2表達可有效抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲，同時本研究提示miR-519d-3p可通過抑制靶基因KPNA2表達而抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，miR-519d-3p在膠質瘤細胞中呈低表達，KPNA2表達上調，上調miR-519d-3p表達可通過靶向抑制KPNA2表達進而減弱膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力，其可能作用機制與上調p21蛋白表達及下調CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達有關，miR-519d-3p可能作為治療膠質瘤的潛在靶點。但miR-519d-3p在體內實驗中的表達如何及其可能作用機制仍需深入研究。