普洱曬青茶頂空固相微萃取條件優化研究

錢 坤 ，李青春，安同偉 ，田向學，楊慧杰 ，沈永鑫

（ 1. 天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心，天津 300402；2. 天津赫萊恩特生物科技有限公司，天津 301702；3.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300384；4.遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽110016；5.島津企業管理（中國）有限公司，北京 100020）

普洱曬青茶是采摘的普洱茶鮮葉經攤涼、殺青、揉捻和干燥制作而成，是制作普洱熟茶和普洱生茶的原料，并在地理保護范圍內采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質特征的茶葉，按其加工工藝的不同，普洱茶可分為普洱熟茶和普洱生茶[1]。其安全性直接影響普洱茶相關產品的安全性。農藥殘留檢測大多需采用多種前處理方法，往往面臨處理時間長、程序復雜等缺陷，樣品的前處理（樣品制備）是其分析的關鍵和難點，直接影響目標分析物準確性、成本和效率[2]。由于茶葉自身含有大量的茶多酚、茶色素、茶多糖、茶氨酸等成分，會嚴重影響農藥殘留的檢測，對目標物帶來干擾[3]。本研究采用HS-SPME技術結合氣相色譜-串聯質譜法建立普洱曬青茶中多種農藥殘留的快速檢測方法，對影響HS-SPME技術的萃取頭類型及其他影響因素進行考察和優化，并對云南省普洱市主要產區的普洱曬青茶進行檢測。

傳統提取方法有液液萃取法（LLE）、索氏提取（SE）、超臨界流體萃?。⊿FE）、加速溶劑提取（ASE）等方法，這些方法易于推廣、應用普遍，但是傳統前處理方法普遍存在操作繁瑣、溶劑用量大、選擇性差、自動控制率低、消耗時間長等缺點。隨著前處理技術水平的不斷提升，高效、快速、少溶劑的樣品前處理新技術和新方法不斷的涌現，其中常見的有：固相萃?。⊿PE）[4]、液相微萃?。↙PME）[5]、分散固相萃取（DSPE）[6]、基質固相分散萃取（MSPD）、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）[7]、固相微萃?。⊿PME）[8]等萃取技術，這些新技術的出現，有效的克服了傳統前處理方法的缺陷，具備操作簡單、萃取效率高、自動化程度高、省時省力、較少使用或無溶劑等優點。SPME技術作為新型的無溶劑樣品前處理技術，在簡化操作流程、節省有機溶劑消耗、減少環境污染和降低勞動力消耗等方面具有獨特的優勢，完全具備分析領域所倡導的“綠色分析”技術特點。目前，該技術在簡單基質中單一幾種或少數幾類痕量化學污染物檢測中有廣泛應用，但對于茶葉這種復雜基質中農藥多殘留的研究尚未有報道。本研究以國家普洱茶質量技術監督檢測中心的長期檢測為參考，篩選出21種常見農藥，采用具有高靈敏度、高選擇性和良好重現性的GC-MS檢測技術，并且針對普洱曬青茶基質特點，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）前處理技術凈化基質，濃縮分析物，并對儀器測定參數和前處理條件進行優化，以提高檢測方法的選擇性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品：曬青茶購自普洱市茶葉交易市場?？瞻讜袂嗖铇悠罚航泧移斩栀|量技術監督檢測中心檢測，未檢測出目標農藥殘留，本樣品用作頂空固相微萃取條件優化空白基質樣品。

有機溶劑：乙腈（色譜純）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲苯（色譜純），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。無機鹽：氯化鈉（分析純），購自天津市北方天醫化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

島津氣相色譜-質譜聯用儀（GCMSQP2020），日本島津公司生產。島津毛細管色譜柱（SH-Rxi-17 Sil MS，30 m × 250μm ×0.25 μm），日本島津公司生產。手動固相微萃取手柄（SPME-GC），美國Supelco公司生產。磁力攪拌器（IT-09A），上海一恒科學儀器有限公司生產。電子天平（YP1200型），上海精科電子有限公司生產。移液槍，德國 Eppendorf公司生產。Milli-Q高純水發生器（Tankmpk 01），美國Millipore公司生產。85 μm PA萃取頭、65 μm PDMS/DVB萃取頭，購自美國Supelco公司。20 mL頂空瓶，購自日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品預處理 曬青茶樣品和曬青茶空白基質樣品經粉碎后過20目篩，粉碎后茶葉裝入鋁箔紙封袋中，放置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 標準溶液的配制 根據21種農藥標準品的濃度進行稀釋到合適的含量作為分析用標準液。

1.3.3 GC-MS條件 （1）GC條件 色譜柱：SHRxi-17 Sil MS，30 m × 250 μm × 0.25 μm毛細管柱。

載氣：高純氦氣（＞99.999%）；載氣流速：1.1 mL·min-1。

進樣方式：手動進樣；進樣模式：不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃。

色譜柱升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃每1 min升至160 ℃，再以5 ℃每1 min升至295 ℃，保持10 min。

（2）MS條件 離子化模式：EI源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；色譜-質譜接口溫度：290 ℃。

質譜掃描方式：全掃描模式（SCAN），掃描質量m/z40～500，確定各化合物掃描離子和保留時間；選擇離子掃描模式（SIM），掃描離子及SIM分組根據全掃描結果確定。

其他質譜參數：采用全氟三丁胺自動調諧后生成參數。

1.4 試驗設計

試驗步驟：稱取1.0 g粉碎空白曬青茶樣加入到20 mL的頂空瓶中，加入4 mL超純水和轉子，聚四氟乙烯密封。將頂空瓶放置于磁力攪拌器上80 ℃的水浴中，300 r·min-1平衡10 min，后插入裝有萃取頭的SPME手柄，推出纖維萃取頭在頂空瓶上部空間萃取60 min，收回萃取纖維頭，拔出SPME手柄插入氣相色譜進樣口，推出纖維萃取頭于一定溫度下（65 μm PDMS/DVB在270 ℃，85 μm PA在290 ℃）解吸附4 min，同時啟動儀器采集數據，每個萃取頭重復萃取3次。

在單因素試驗考察的基礎上，利用Minitable 17（Minitab Inc., USA）進行Plackett-Burman試驗設計，試驗分別對加鹽量、萃取溫度、萃取時間、溶液pH值、加水量和攪拌速率6個影響因素進行全面考察，選擇N=12的Plackett-Burman設計，根據單因素試驗的結果確定Plackett-Burman試驗的低水平（-1）值和高水平（1）值，以萃取目標化合物的峰面積為響應值。在HS-SPME分析中，pH值的改變往往可影響基質溶液的性質，進而改變目標分析物在樣品基質和固定相之間的分配系數，同時提高待分析物的穩定性，提高萃取頭對目標分析物質的萃取效率和分析結果的準確性。試驗通過采用HCl和NaOH調節基質溶液的pH值，考察pH值對萃取頭吸附目標農藥檢測峰面積的影響。對于85 μm PA，pH值為4時萃取量達到最大，隨著pH值的進一步升高，萃取量有減小的趨勢；對于65 μm PDMS/DVB隨著pH值的增加，萃取量有增加的趨勢，但是對于85 μm PA和65 μm PDMS/DVB來說，改變pH值對萃取頭萃取影響都不是很明顯，因此在萃取過程中選擇直接加入超純水，不進一步調整溶液pH值。試驗設計如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素和水平

2 結果與分析

2.1 響應面因素水平

根據Plackett-Burman試驗篩選的結果，對影響85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取效率的重要影響因子采用Design-Expert 8. 0. 5b 軟件（State-Ease Inc., USA）進行Box-Behnken試驗設計（表2），進一步根據試驗的響應值（峰面積）進行數據分析，從而得到顯著影響85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取效率的各因子的最佳取值。采用方差分析、F檢驗和回歸顯著性分析對模型的擬合進行檢驗分析。同時采用方差分析和t檢驗對影響因子及其交互作用進行顯著性檢驗,刪除無統計學顯著意義的參數（P＞0.05），進而簡化預測模型。

表2 Box-Behnken實驗設計及水平

2.2 回歸方程及系數分析

根據表1因素和水平，分別采用Minitab軟件進行試驗設計（表3），同時根據設計程序下85 μm PA和65 μm PDMS/DVB檢測到農藥殘留總峰面積進行數據回歸分析。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果

在試驗設計和檢測的基礎上，采用Mintab軟件對檢測結果進行分析，經過回歸擬合，85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭各影響因素對檢測結果有顯著影響作用。PA影響因素回歸方程：

PDMS/DVB影響因素回歸方程：

通過對回歸模型進行方差分析，結果如表4所示，2個回歸模型均極顯著（85 μm PA:P=0.000；65 μm PDMS/DVB:P=0.001），失擬項均不顯著（85 μm PA:P=0.124；65 μm PDMS/DVB:P=0.517），同時也表明了未知因素對萃取結果的影響較小。85 μm PA和65 μm PDMS/DVB 2個萃取頭模型R2adj分別為93.44%和93.95%，表明了2個模型與試驗擬合度較好，可以采用模型對85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取GC-MS檢測響應值進行預測分析。85 μm PA萃取頭模型中A、B、A2、B2、C2、D2對萃取檢測響應值影響極其顯著（P＜0.01），表明了萃取溫度、鹽添加量、萃取時間和加水量4個因素對萃取檢測響應值的影響不是單純的線性關系，其中還存在二次項對萃取檢測響應值的顯著影響，而兩兩因素之間AB、AC、AD、BC、BD、CD對萃取頭檢測響應值影響均不顯著（P值為0.067～0.942之間），說明模型中因素之間交互作用較?。?5 μm PDMS/DVB萃取頭模型中，A、B、A2、B2、C2對萃取檢測響應值影響極顯著（P＜0.01），萃取溫度、鹽添加量和萃取時間3個因素對萃取檢測響應值同時存在線性和二次項的影響，兩兩因素之間AB、AC、BC對萃取頭檢測響應值影響均不顯著（P值為0.303～0.967之間），說明模型中因素之間交互作用較小。

表4 回歸模型方差分析

2.3 響應面分析及優化

2.3.1 PA萃取頭影響因素響應面 在回歸模型分析的基礎上，利用Mintab軟件，將影響85 μm PA萃取的4個因素（萃取溫度、鹽濃度、萃取時間和加水量）中的其中2個因素固定在中心水平，繪制2個因素相應的曲面圖和等高線圖，結果如圖1—圖6所示。

試驗固定萃取時間和加水量不變，繪制響應曲面和等高線圖如圖1所示，隨著萃取溫度和鹽添加量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，可見萃取溫度和鹽添加量之間交互作用不明顯。

圖1 萃取溫度和鹽添加量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定鹽添加量和加水量不變，繪制響應曲面和等高線圖如圖2所示，隨著萃取溫度和萃取時間的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先上升后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和萃取時間之間交互作用不明顯。

圖2 萃取溫度和萃取時間對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定鹽添加量和萃取時間不變，繪制響應曲面和等高線圖如圖3所示，隨著萃取溫度和加水量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和加水量之間交互作用不明顯。

圖3 萃取溫度和加水量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定萃取溫度和加水量，繪制響應曲面和等高線圖如圖4所示，隨著鹽添加量和萃取時間的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，鹽添加量對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，鹽添加量和萃取時間之間交互作用不明顯。

圖4 鹽添加量和萃取時間對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定萃取溫度和萃取時間，繪制響應曲面和等高線圖如圖5所示，隨著鹽添加量和加水量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，鹽添加量對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，鹽添加量和加水量之間交互作用不明顯。

圖5 鹽添加量和加水量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定萃取溫度和鹽添加量，繪制響應曲面和等高線圖如圖6所示，隨著萃取時間和加水量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取時間對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取時間和加水量之間交互作用不明顯。

圖6 萃取時間和加水量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

2.3.2 PDMS/DVB萃取頭影響因素響應面 在回歸模型分析的基礎上，利用Mintab軟件，將影響65 μm PDMS/DVB萃取的3個因素中的其中1個因素固定在中心水平，繪制2個因素相應的曲面圖和等高線圖，結果如7至圖9所示。

試驗固定萃取時間，繪制響應曲面和等高線圖如圖7所示，隨著萃取溫度和鹽添加量的增加，65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和鹽添加量之間交互作用不明顯。

圖7 萃取溫度和鹽添加量對65 μm PDMS/DVB萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定鹽添加量，繪制響應曲面和等高線圖如圖8所示，隨著萃取溫度和萃取時間的增加，65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和萃取時間之間交互作用不明顯。

試驗固定萃取溫度，繪制響應曲面和等高線圖如圖9所示，隨著鹽添加量和萃取時間的增加，65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取檢測峰面積均呈現先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，鹽添加量對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，鹽添加量和萃取時間之間交互作用不明顯。

圖9 萃取時間和鹽添加量對65 μm PDMS/DVB萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

3 結 論

分別對2個回歸模型求解，得到85 μm PA萃取頭4個影響因素的最優值分別為：萃取溫度95℃、鹽添加量1.65 g、萃取時間66 min、加水量 4 mL；65 μm PDMS/DVB萃取頭3個影響因素的最優值分別為：萃取溫度64 ℃、鹽添加量1.19 g、萃取時間 62 min。結合單因素對其他因素的考察結果，在最優條件確定的基礎上，響應面試驗進程3次萃取試驗驗證，結果顯示，優化檢測方法可靠，可應用于萃取與檢測。