重組人Dickkopf相關蛋白1在氟化鈉所致PC12細胞損傷中的作用及其機制

岳蘇陽，丁 欽，李慧華，陳 銳*

0 引言

氟化物廣泛存在于自然界和日常生活中，目前正成為一種不可避免的環境污染物，其能夠引起海馬神經元損傷、影響神經再生以及突觸可塑性。有研究表明，氟化物的細胞毒性與細胞凋亡、氧化應激、DNA和RNA的一般變化以及蛋白質的生物合成有關[1]。長期暴露會導致氟中毒和不可逆轉的腦損傷，并誘導神經元凋亡，損害神經發生、突觸的可塑性以及突觸的功能，破壞突觸相關蛋白的表達，導致大腦皮層微管相關蛋白2(MAP2)、突觸素(SYP)和發育受調節的腦蛋白(Dbn)在蛋白和mRNA水平上的表達明顯降低，氟化物介導的認知功能障礙的減少可能是由于這些突觸相關蛋白表達的破壞，導致神經元功能減弱而引起[2-3]。有研究表明，Wnt信號通路參與了暴露于氟化物的PC-12細胞的抗增殖過程，DDK1則能夠減弱PC-12細胞中氟化物的抗增殖活性[4]。此外，氟化物可通過JNK和Wnt信號通路來抑制細胞增殖。

Dickkopf-1 (DKK-1)在體內參與了許多病理生理過程，其異常表達不僅會改變典型Wnt/β-catenin信號通路中相關蛋白和基因的表達，還會改變其他信號通路中相關蛋白和基因的表達。以往對DKK-1的研究主要集中在其在腫瘤中的作用，近年大量研究表明，其在胚胎發育、神經再生、突觸形成等方面發揮著重要作用，因此，DKK-1在神經發育不良、認知功能障礙、情緒障礙等神經精神疾病中的作用越來越受到人們的重視[5]。DKK-1作為調控Wnt通路的關鍵負性因子，在正常腦組織中很少表達，但是DKK-1在發生神經元凋亡的腦組織中高表達，提示DKK-1可能參與了神經元凋亡的過程[6]。DKK-1在許多腫瘤中低表達，但在部分腫瘤中高表達，越來越多的證據表明，DKK-1在不同腫瘤的發生、發展和轉移中起著復雜而不同的作用[7]。因此，筆者提出設想，DKK-1可通過誘導氟中毒神經細胞的凋亡，抑制神經再生，從而改變認知功能。本實驗通過對PC12細胞給予氟化鈉處理，觀察PC12細胞的增殖、凋亡情況以及DKK-1、β-catenin的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞株購自上海中科院細胞所，NaF購自德國耶拿生物科學公司，RPMI-1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)購自美國Gemini公司，蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自徐州博立達生物科技有限公司，CCK-8購自日本同仁化學研究所，DKK-1、β-catenin兔單克隆抗體購自美國Abcam公司，actin鼠單克隆抗體購自美國Santa公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養 用含10%FBS、雙抗的RPMI-1640培養基作為生長培養基，將PC12細胞接種到半徑5 cm的培養皿中，置于5%CO2培養箱內培養，培養溫度為37 ℃。待細胞生長密度達70%～80%后，用胰蛋白酶EDTA消化液加以消化細胞，按1∶3予以分皿傳代。

1.2.2 CCK-8檢測相關細胞增殖率 細胞以5×103/孔密度接種到96孔板中，待細胞貼壁后加入2 000 μM NaF，干預0、6、12、24、48 h。每組設置了6個副孔。吸除培養基，用37 ℃ PBS洗2次，每孔加入100 μl用培養基配制的10%CCK-8液體，在37 ℃、5%CO2條件下培育1 h，并使用450 nm波長酶標儀測定吸光度值。

1.2.3 Western blot方法檢測DKK-1與β-catenin蛋白表達水平 按照“1.2.2”所示分組，2 000 μM NaF干預，按照試劑盒說明書步驟予以提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白轉移至NC膜上，牛奶室溫封閉2 h，1抗4 ℃孵育過夜，Washing buffer清洗5 min×3次，熒光2抗室溫孵育2 h，Washing buffer清洗5 min×3次，Odyssey紅外激光成像，Image J軟件分析灰度值。

1.2.4 轉染 轉染前24 h，用胰蛋白酶處理處于對數生長期的PC12細胞，以含10%血清的培養基調整細胞密度約5×106個細胞/15 ml，重新接種于10 cm細胞培養皿，37 ℃、5%CO2培養箱內培養。24 h待細胞密度達70%～80%時即可用于轉染；向滅菌離心管中加入無雙抗培養基與病毒液(10 μl n-siRNA、10 μl Dkk1-siRNA)，調整總體積為6 ml，混勻后，給細胞換液，于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。培養24 h后，棄去含有轉染混和物的培養基，加入2 ml PBS液清洗2次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄；然后緩慢加入含10%血清的細胞培養基6 ml，于37 ℃、含5%CO2培養箱內繼續培養48 h，于熒光顯微鏡下觀察轉染情況，若效果較好，則予以提取細胞蛋白，Western blot檢測DKK-1干擾效果。轉染成功后加入NaF藥物干預，檢測Wnt/β-catenin通路蛋白變化。依據說明書，運用Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 NaF對PC12細胞活性的影響 光鏡下觀察，對照組細胞貼壁良好，細胞呈梭形，向外突起明顯。細胞經NaF損傷后，細胞皺縮，突起變短，部分細胞甚至脫落。CCK-8結果顯示，與對照組相比，氟化鈉藥物組細胞活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

圖1 NaF對PC12細胞活性的影響

*P<0.05,**P<0.01

2.2 NaF對DKK-1蛋白表達的影響 Western blot方法檢測NaF對DKK-1蛋白表達的影響，與對照組比較，NaF損傷24 h和48 h后，DKK-1蛋白的表達隨著NaF損傷時間的增加而升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot方法檢測NaF損傷后細胞中DKK-1蛋白表達

2.3 轉染 熒光顯微鏡下觀察空載病毒(n-siRNA)與DKK-1干擾病毒(DKK-1-siRNA)轉染情況，WB方法結果提示DKK-1干擾效果較好(圖3)。

圖3 DKK-1-siRNA與n-siRNA干擾結果對比

2.4 DKK-1對Wnt/β-catenin信號通路的影響 與n-siRNA對比，NaF組DKK-1蛋白表達明顯升高，β-catenin蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與n-siRNA+NaF組對比，DKK-1-siRNA組DKK-1蛋白表達降低，β-catenin蛋白表達升高(P<0.05)。見圖4。

2.5 DKK-1對細胞凋亡的影響 與n-siRNA對比，n-siRNA+NaF組細胞凋亡增多。與n-siRNA+NaF組對比，DKK-1-siRNA組細胞凋亡減少。見圖5。

3 討論

流行病學研究報告顯示，高氟化飲用水可能會顯著降低接觸兒童的智商(IQ)。有報道，突觸可塑性是發展兒童的學習和記憶技能的基礎[8]。氟化物暴露與智商的關系呈分段線性關系，具有閾值和飽和效應，而適度過量氟化物暴露主要與優秀智力的喪失有關[9]。

過量氟化物暴露導致的細胞凋亡、智力受損主要有以下機制：①內質網應激(ERS)誘導的神經元損傷：一定劑量的NaF可以導致神經元細胞凋亡，其中過量的氟產生了過量的ROS，誘導神經元中過度的氧化應激和ERS，加劇了神經元的凋亡，并且在細胞凋亡水平與細胞內ROS水平之間呈線性關系，最后導致損傷[10]。②JNK途徑：高劑量的NaF通過半胱天冬酶介導但不依賴ROS的途徑中的細胞凋亡導致hESC死亡，并伴隨著磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)水平的增加。用p-JNK特異性抑制劑(SP600125)進行預處理可以以濃度和時間依賴性方式有效保護hESC免受NaF誘導的細胞死亡[11]。③Fas-L途徑：在一定的研究條件下，Fas-L依賴性信號通路被激活，進而使得NaF誘導了低水平的細胞凋亡[12]。④Wnt/β-catenin 信號通路：氟能夠通過激活Wnt/β-catenin 途徑，并改變相關基因的表達和細胞中β-catenin蛋白的位置，從而調節細胞的增殖[13]。⑤M1和M3毒蕈堿型乙酰膽堿受體的表達水平：慢性氟中毒大鼠學習和記憶障礙的機制可能與mAChRs中M1和M3表達的降低有關[14]。⑥氟化物對某些神經遞質水平的改變及其神經毒性：氟化物含量的增加導致某些神經遞質(如腎上腺素、組胺、5-羥色胺和谷氨酸鹽)的水平升高，而去甲腎上腺素、乙酰膽堿和多巴胺的水平呈劑量依賴性降低。同時，脂質過氧化作用顯著增加，抗氧化防御系統受損。研究結果表明高劑量的NaF對神經有毒性作用[15]。考慮到氟化物可通過JNK和Wnt信號通路來抑制細胞增殖，隨著 Wnt信號通路的活化，氟暴露水平的增加，GSK3β、β-catenin含量以及DKK-1、GSK3β、β-catenin 的異常檢出率逐漸增加，但 DKK-1 含量顯著降低[16-17]。DKK-1作為調控Wnt通路的關鍵負性因子，在正常腦組織中很少表達，但其在發生神經元凋亡的腦組織中高表達，提示DKK-1可能參與了神經元凋亡的過程[8]。

圖4 DKK-1對Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖5 DKK-1對細胞凋亡的影響

Dickkopf(DKK)家族由脊椎動物中的4個分泌蛋白組成(DKK 1、2、3、4)，是Wnt信號通路最關鍵的拮抗劑家族之一，其中DKK-1主要通過與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/LRP6)受體及Kremen-1/2結合成復合物而阻斷Wnt信號傳導[18-19]。DKK-1是信號通路Wnt/β-catenin通路的抑制劑，在腫瘤發生過程中發揮著相互矛盾的作用，既可以作為腫瘤轉移的癌基因啟動子，也可以作為腫瘤抑制子，DKK-1可以通過重塑腫瘤微環境和誘導炎癥，促進腫瘤的侵襲和遷移[20]。

Wnt信號傳導異常與幾種疾病有關，例如AD、癲癇、代謝性疾病等。其中阿爾茨海默氏病(AD)是老年性癡呆的最常見形式，其特征是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積在特定的大腦區域，由Aβ誘導的Wnt信號的下調與AD的疾病進展有關。此外，越來越多的證據支持Wnt信號在胚胎發育過程中的中樞神經系統(CNS)發育以及成年大腦的結構和功能調節中起著關鍵作用。更重要的是，通過Wnt配體持續激活Wnt信號，或抑制Wnt信號的負調節劑，例如在疾病中活躍的DKK-1和GSK-3β，能夠降低Aβ毒性并改善AD的認知能力[21]。因此，Wnt信號通路抑制劑DKK-1也可能通過影響神經干細胞的再生，引起氟中毒所致的認知功能障礙。本實驗發現，NaF會影響細胞的活性，降低其增殖能力，并且隨著NaF干預時間的增加，DKK-1蛋白的表達水平也隨之增高。此外，DKK-1還與細胞凋亡之間存在密切聯系，通過阻斷Wnt /β-catenin途徑能夠促進Eca109細胞的凋亡[22]。Zhang等[23]研究發現，DKK-1表達的降低，使得Wnt /β-catenin信號通路激活，進而促進成骨細胞增殖。反之，DKK-1的異位表達可抑制細胞增殖，或通過凋亡增強因子誘導凋亡[24]。本項研究發現，NaF能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活進而誘發細胞凋亡，反之，干擾DKK-1的表達后，Wnt/β-catenin信號通路重新激活，細胞凋亡減少。

綜上所述，DKK-1能促進氟化鈉導致的神經細胞PC-12凋亡，其作用機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而發揮作用。明確DKK-1在氟中毒所致認知障礙中的作用機制，將為氟中毒所致認知功能障礙的后續治療和及早干預提供新的可能策略，也能夠為今后靶向藥物的研發提供理論參考依據。