姜黃素通過抑制NF-κB信號通路和NLRP3炎性體軸調控大鼠急性胰腺炎的研究

徐 娟，陳卓鋒，王治偉

0 引言

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的一種胰腺組織炎癥反應性疾病，由胰蛋白酶原異常活化引起[1]，具有很高的發病率和死亡率。近年來，AP的發病率逐年增加[2]，大約有20%的患者會發展為重癥急性胰腺炎(SAP)，甚至有一些患者由于其引發的全身性炎癥反應綜合征和多種器官衰竭而死亡[3-4]。AP早期典型的特征是消化酶誘導的胰腺腺泡細胞局部壞死，然后觸發促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等的產生[5]，并促使這些炎性因子募集到炎癥發生部位，從而加劇了胰腺損傷以及病情的惡化等[6-7]。盡管近幾十年對AP進行了大量的研究，但是引起胰腺炎性反應的病理生理機制仍未被完全闡明，并且尚未開發出有效的治療藥物和方法。

核因子-κB(NF-κB)是一種核促炎轉錄因子，可調節多種基因的表達，而這些基因表達對于炎癥信號通路的轉導起著至關重要的作用[8]。NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體介導了機體對微生物感染和細胞損傷的免疫應答，是多種疾病病理生理機制的重要組成部分[9]。在AP的研究中，NF-κB和炎癥介質的作用不斷受到重視。研究表明，NF-κB與NLRP3炎性小體參與AP的發生，抑制NF-κB通路與NLRP3炎性小體激活可減輕胰腺和其他器官的損傷[10-12]。

姜黃素(Curcumin)是一種來源于姜黃根莖且具有活性的多酚物質，已有研究證明，姜黃素不僅具有抗炎、抗氧化與抗腫瘤作用[13]，還能夠通過抑制腫瘤細胞生長與轉移有效阻止腫瘤發生發展[14]。因此，本研究旨在探討姜黃素對牛磺膽酸鈉誘導的AP大鼠的保護作用，以及對NF-κB通路與NLRP3炎性體軸的作用機制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 主要試劑：姜黃素(質量分數>95%)購自天津科密歐化學試劑有限公司，2%戊巴比妥鈉購自上海邦景實業有限公司，5%牛磺膽酸鈉購自上海鼓臣生物技術有限公司，血清淀粉酶和脂肪酶檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，蘇木素、伊紅染液購自美國Sigma公司；山羊血清、5%脫脂牛奶購自美國Gibco公司；抗NLRP3、NF-κB、caspase-1、ASC、p65、IκBα、p-p65以及鼠抗β-actin、抗辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG等抗體均購自美國Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白測定試劑盒與TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

動物：84只健康SPF級Wistar大鼠，雄性，6～8周齡，體重180～220 g，購自廣州醫科大學實驗動物中心，合格證號：SYXK(粵)2018-0013。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組、造模及給藥 84只雄性Wistar大鼠實驗前在溫度為20～25 ℃、濕度為45%～55%、12 h明暗交替的飼養環境內適應性喂養1周，自由飲水及攝食。參照文獻[15]制備AP模型。在造模前所有大鼠禁食12 h，然后隨機分為4組(每組21只)：模型組、假手術組、姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組。模型組通過腹膜內注射2%戊巴比妥鈉麻醉，將5%牛磺膽酸鈉溶液穿刺管逆行注射到膽胰管建立AP模型；假手術組大鼠用等量生理鹽水代替5%牛磺膽酸鈉溶液進行注射，其他操作均與模型組相同；姜黃素低劑量組在注射牛磺膽酸鈉前1 h腹腔注射姜黃素50 mg/kg，然后在注射牛磺膽酸鈉后每天注射姜黃素(50 mg/kg)1次，持續3 d；姜黃素高劑量組在注射牛磺膽酸鈉前1 h腹腔注射姜黃素100 mg/kg，然后在注射牛磺膽酸鈉后每天注射姜黃素(100 mg/kg)1次，持續3 d。3 d后采集大鼠下腔靜脈血，采血完畢處死所有大鼠，解剖取大鼠胰腺組織，將一部分胰腺組織固定在4%多聚甲醛中，將另一部分置于液氮后儲存在-80 ℃下。

1.2.2 血清淀粉酶和脂肪酶活性測定 抽取血液自然凝固后，4 ℃下以2 000 r/min的速度離心10 min分離血清，通過比色法檢測血清淀粉酶和脂肪酶活性。①淀粉酶活性測定步驟：將底物緩沖液在37 ℃預溫5 min，加入稀釋的血清，混勻，37 ℃反應7.5 min，加入碘應用液，立即加水混勻，以蒸餾水調零，使用酶標儀在660 nm處測定各管的吸光度(OD)值。②脂肪酶活性測定步驟：將底物緩沖液在37 ℃預溫6 min，依次加入待測血清、底物緩沖液，混合均勻，在酶標儀420 nm處測定吸光度值A1，接著在37 ℃反應10 min，再次讀取吸光度值A2。

1.2.3 ELISA法 將收集的血液，室溫下孵育2 h后，4 ℃下以2 000 r/min的速度離心10 min分離血清，檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，具體操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。用酶標儀在450 nm處測定OD值。

1.2.4 HE染色 將4%多聚甲醛溶液中固定好的胰腺組織取出，進行脫水與石蠟包埋，切成5 μm切片。37 ℃干燥過夜，60 ℃處理20 min，將玻片浸入二甲苯中泡片10 min，使用由高到低的梯度酒精(100%，90%，80%和70%)浸泡，每次2 min，在流水下沖洗。然后使用蘇木精染色5 min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3 min，由低到高的梯度酒精(70%，80%，90%和100%)依次脫水，二甲苯浸泡5 min，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下進行組織病理學檢查。

1.2.5 免疫組織化學染色 將石蠟切片脫蠟至水，PBS溶液中浸泡5 min，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，4%過氧化氫清除內源性過氧化物酶活性，加山羊血清液室溫孵育30 min，然后分別滴加兔抗NLRP3(1∶200)與兔抗NF-κB(1∶200)作為一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBS沖洗，滴加二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，使用蘇木素進行復染，常規脫水、透明，中性樹膠封片，在電子顯微鏡下進行圖像采集與分析。若胞漿呈黃色細顆粒狀則判斷為陽性產物。

1.2.6 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液提取各組大鼠胰腺組織總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg各組蛋白樣本進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后分別加兔抗NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)以及鼠抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌，采用化學發光試劑(ECL)顯影后，使用Quantity One軟件分析蛋白質灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠胰腺組織病理性形態學觀察 HE染色結果如圖1所示，假手術組胰腺組織結構清晰正常，未出現明顯炎性細胞浸潤、充血的現象；模型組胰腺組織局部壞死、出血以及水腫，腺泡細胞結構模糊，出現大量炎癥細胞浸潤，間隔明顯變寬；姜黃素低劑量組胰腺組織局部壞死、出血及水腫減輕，腺泡細胞結構不完整，而炎癥細胞浸潤減少；姜黃素高劑量組胰腺組織局部壞死、出血及水腫顯著改善，偶見少量炎癥細胞浸潤，腺泡細胞結構較完整。

圖1 HE染色檢測各組大鼠胰腺組織病理形態變化

2.2 各組大鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量比較 各組大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶測定結果如圖2所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清淀粉酶含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組大鼠血清淀粉酶含量降低，且具有劑量依賴性(P<0.01)。與假手術組比較，模型組大鼠血清脂肪酶含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組大鼠血清脂肪酶含量呈劑量依賴性地降低，且差異有統計學意義(P<0.01)。

圖2 比色法測定各組大鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平比較 各組大鼠血清炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α檢測結果見表1，與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高；與模型組比較，姜黃素低、高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平逐漸降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。

2.4 各組大鼠胰腺組織NLRP3、NF-κB通路蛋白陽性表達率比較 通過免疫組化染色觀察胰腺組織NLRP3、NF-κB的陽性表達情況，結果如圖3所示。與假手術組比較，模型組NLRP3、NF-κB蛋白陽性表達率升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組NLRP3、NF-κB蛋白陽性表達率均降低，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 ELISA法檢測各組大鼠血清炎性因子水平(pg/ml，n=21)

圖3 免疫組織化學染色檢測各組大鼠胰腺組織NLRP3、NF-κB的陽性表達

2.5 各組大鼠胰腺組織NLRP3、NF-κB通路蛋白表達水平比較 Western blot檢測各組大鼠胰腺組織中NLRP3炎性體和NF-κB通路相關蛋白的表達情況，結果如圖4所示。

結果顯示，與假手術組比較，模型組NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達呈劑量依賴性降低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組IκBα蛋白表達降低(P<0.01)，p-p65、p65蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組IκBα蛋白表達升高(P<0.01)，而p-p65、p65蛋白表達降低，均具有劑量依賴性(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測各組大鼠胰腺組織NLRP3炎性小體和NF-κB通路相關蛋白的表達

3 討論

AP的發生機制較為復雜，其臨床特點為上腹痛、惡心、嘔吐與發熱等。其病情發展迅速，嚴重時導致多器官損傷從而引起死亡[16]。本研究通過逆行胰膽管穿刺法制備AP大鼠模型，檢測結果顯示，胰腺腺泡細胞大量壞死，出現大面積炎癥細胞浸潤，血清淀粉酶和脂肪酶含量增加，血清炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高，表明模型大鼠胰腺組織出現嚴重炎癥性損傷和組織病理改變，提示大鼠AP模型制備成功。改善AP關鍵在于控制炎癥反應，通過減少炎癥反應來減輕胰腺損傷，進而促進腸道功能恢復并防治多器官功能并發癥[6]。

本研究顯示，姜黃素低劑量組與高劑量組大鼠胰腺組織損傷程度逐步減輕，血清淀粉酶和脂肪酶含量呈下降趨勢，IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低。說明姜黃素可減輕AP模型大鼠胰腺組織損傷，改善胰腺炎時微循環的狀況。胰腺腺泡細胞中的淀粉酶和脂肪酶通常用作AP診斷的生化標記，這些酶會使腺泡細胞發生損傷，促進局部和全身性炎癥反應[17]。同樣，各種炎性因子的過度釋放會導致腺泡細胞發生凋亡和壞死，從而引發局部胰腺炎發展為全身性炎癥反應[18]。TNF-α和IL-6為促發早期胰腺炎的重要誘因，在其刺激下，單核巨噬細胞會釋放更多的內源性炎癥介質，并上調黏附分子水平，從而介導組織損傷、脂質過氧化、細胞腫脹和死亡的發生[19]。本研究中，姜黃素處理阻止了血清淀粉酶和脂肪酶含量的增加，以及IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，這表明姜黃素可能會減少AP期間外分泌酶的過度分泌與炎性因子的產生。

NF-κB在多種炎癥反應信號通路中發揮重要作用，是調節炎癥反應和免疫反應的關鍵性核轉錄因子，激活后會導致多種炎癥細胞因子的產生，NF-κB信號通路激活是AP發展過程中的關鍵一步[20]。研究表明，抑制NF-κB可以延長牛磺膽酸鹽誘導的胰腺炎大鼠的生存時間并減輕炎癥反應，NF-κB持續升高可能導致慢性胰腺炎發生惡化[21]。本研究結果與先前的結果一致，AP大鼠胰腺組織中NF-κB的陽性表達增加，IκBα蛋白表達降低，p-p65、p65蛋白表達升高，而低劑量和高劑量姜黃素能使胰腺組織中NF-κB陽性表達水平逐步下降，IκBα蛋白表達升高，p-p65、p65蛋白表達降低。

NLRP3炎性小體是由無活性的caspase-1前體、NLRP和凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)組成的復合體，能夠識別多種誘導炎癥的刺激并激活caspase-1，進而促進IL-1β和IL-18的成熟以及其他一些重要促炎因子產生與釋放，最終使組織細胞發生炎癥反應[22-23]。本研究中，AP大鼠胰腺組織中NLRP3的陽性表達增加，NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達升高，而低、高劑量姜黃素均能使胰腺組織中NLRP3陽性表達以及NLRP3、caspase-1、ASC蛋白水平下降。ASC作為NLRP3炎性小體的銜接蛋白，能夠把caspase-1前體與NLRP3連接起來，形成高濃度caspase-1前體并使自身活化，形成具有酶活性的caspase-1[24]。caspase-1作為炎性小體的效應蛋白，可以將無活性的IL-18和IL-1β前體剪切為成熟且具有功能的IL-18和IL-1β[25]。

綜上所述，姜黃素可減輕AP大鼠的胰腺組織損傷，減少血清脂肪酶和淀粉酶含量并降低炎性因子的水平，抑制NF-κB通路與NLRP3炎性體軸激活，提示姜黃素對AP大鼠具有保護作用。