RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定五味清濁散中3種成分的含量

李 柯，楊 蕾，孟令嘉，劉 煒

0 引言

五味清濁散系蒙古族驗(yàn)方，由石榴、紅花、豆蔻、肉桂、蓽茇五味藥材經(jīng)粉碎、過(guò)篩、混合等工藝加工制成的中藥散劑，具有開(kāi)郁消食、暖胃等功效，臨床主要用于治療食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、腹脹泄瀉等病癥[1-5]；方中紅花有活血通經(jīng)、散瘀止痛等功效[6-10]，肉桂有補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈等功效[11-14]，蓽茇有溫中散寒、下氣止痛等功效[15-19]；五味清濁散收載于《中國(guó)藥典》2015年版中，產(chǎn)品各論中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)[20]，不能較好地顯示藥品的質(zhì)量水平和保障廣大患者的用藥安全。本研究建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定五味清濁散中活性成分山柰素、桂皮醛和胡椒堿含量的分析方法，試驗(yàn)證明方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于五味清濁散產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Alliance E2695型高效液相色譜儀，配備2998二極管陣列檢測(cè)器(沃特世科技公司)；Agilent zorbax XDB-C18色譜柱(安捷倫科技公司，250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；Mettler toledo XS-204DU型電子天平(梅特勒-托利多科技公司)；KQ 3200D型超聲儀(昆山超聲設(shè)備公司)；Milli-Q A10型超純水處理系統(tǒng)(密理博科技公司)。

1.2 試藥 五味清濁散(規(guī)格：每袋裝3 g，批號(hào)：20181106、20190409、20190715，阜新蒙藥有限責(zé)任公司生產(chǎn))；對(duì)照品：山柰素(批號(hào)：110861-201812，含量以93.8 %計(jì))；桂皮醛(批號(hào)：110710-201821，含量以99.6%計(jì))；胡椒堿(批號(hào)：110775-201706，含量以98.9%計(jì))，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇：HPLC級(jí)，購(gòu)自德國(guó)默克公司；濃磷酸：優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；純化水：自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Extend C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，4.5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：319 nm；流速：1.0 ml/min；流動(dòng)相：流動(dòng)相A(乙腈)-流動(dòng)相B(0.5%磷酸溶液)，梯度洗脫，洗脫程序：0～5 min 17%A，5～21 min 17%～43%A，21～29 min 43%～74%A，29～30 min 74%～17%A，30～35 min 17%A；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 取山柰素對(duì)照品26.65 mg、桂皮醛對(duì)照品25.10 mg、胡椒堿對(duì)照品25.28 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密量取“2.2.1”混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0 ml，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。

2.2.3 供試品溶液 取五味清濁散樣品，研缽研成細(xì)粉，混勻；取研細(xì)后的粉末1.0 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加75%甲醇溶液20 ml，超聲提取20 min(功率180 W，頻率75 kHz)，取出放至室溫，加75%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液 按五味清濁散藥材配比比例和加工制備方法，制備缺紅花、肉桂和蓽茇的陰性樣品，陰性供試品按“2.2.3”方法進(jìn)行處理，得陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2.2”對(duì)照品溶液、“2.2.3”供試品溶液和“2.2.4”陰性供試品溶液，按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；結(jié)果山柰素、桂皮醛和胡椒堿3種活性成分在該色譜條件下，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于5 000，符合要求，且陰性供試品溶液中無(wú)干擾峰。典型譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，制備含山柰素、桂皮醛和胡椒堿濃度分別為0.3、0.6、1.0、3.0、6.0、10.0、15.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加75%甲醇溶液定容至刻度，搖勻；按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；以3種活性成分響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果3種活性成分在0.3～15.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取五味清濁散樣品(規(guī)格：3 g/袋，批號(hào)：20181106)，按“2.2.3”供試品溶液前處理方法制備供試品溶液，同法共制備6份供

表1 山柰素、桂皮醛和胡椒堿線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

試品溶液；按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以3種成分含量計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；結(jié)果山柰素、桂皮醛和胡椒堿含量RSD分別為3.5%、4.2%和2.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”對(duì)照品溶液，按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，按山柰素、桂皮醛和胡椒堿峰面積計(jì)算RSD；結(jié)果山柰素、桂皮醛和胡椒堿精密度RSD分別為2.1%、2.3%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取五味清濁散樣品(規(guī)格：3 g/袋，批號(hào)：20181106)，按“2.2.3”供試品溶液前處理方法制備供試品溶液，室溫下分別放置0、1、3、6、9、18、24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣1次，按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以3種成分峰面積計(jì)算RSD；結(jié)果山柰素、桂皮醛和胡椒堿峰面積RSD分別為2.2%、1.9%、1.3%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的五味清濁散樣品(規(guī)格：3 g/袋，批號(hào)：20181106)，研缽研成細(xì)粉，混勻；取研細(xì)后的粉末1.0 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，分別加入“2.2.1”混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液一定量，后續(xù)按“2.2.3”供試品溶液處理，同法共制備6份樣品加標(biāo)溶液；按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算山柰素、桂皮醛和胡椒堿加樣回收率結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果

2.4 市售樣品含量測(cè)定 取市售五味清濁散樣品(規(guī)格：3 g/袋，批號(hào)：20181106、20190409、20190715，阜新蒙藥有限責(zé)任公司)樣品，按“2.2.3”供試品溶液處理，得供試品溶液；按“2.1”色譜條件，待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算山柰素、桂皮醛和胡椒堿的含量結(jié)果。見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取山柰素對(duì)照品、桂皮醛對(duì)照品和胡椒堿對(duì)照品，分別配制6.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在190～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果山柰素、桂皮醛和胡椒堿分別在365 nm、292 nm和343 nm處有最大吸收，為使3種活性成分在“2.1”色譜條件下響應(yīng)良好，故選擇319 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，試驗(yàn)證明，選擇該波長(zhǎng)，3種活性成分響應(yīng)良好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

表3 樣品含量檢測(cè)結(jié)果

3.2 流動(dòng)相選擇 分別選擇乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.5%磷酸溶液和甲醇-0.5%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系，考察不同體系對(duì)3種成分分離的影響；按“2.1”色譜條件，保持其他條件不變，分別采用上述4種流動(dòng)相體系，考察3種活性成分分離情況。因此，選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，山柰素、桂皮醛和胡椒堿分離度最佳，且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。

綜上所述，研究建立采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定五味清濁散中活性成分山柰素、桂皮醛和胡椒堿含量的分析方法，可以用于五味清濁散中活性成分山柰素、桂皮醛和胡椒堿含量的測(cè)定。