反向-HPLC法同時檢測復方益肝丸3種活性成分的含量

李業雨,劉世萍,馬妍妍,海 鑫

0 引言

復方益肝丸是由茵陳、龍膽、牡丹皮、丹參、大黃、紅花等28味藥材提取加工而成的一種中藥成方制劑[1-4]，具有清熱利濕、疏肝理脾、化瘀散結等功效，臨床上常用于濕熱毒所致的脅肋脹痛、黃疸、口干口苦、苔黃脈弦等，尤其對急、慢性肝炎有較好的治療效果；因其不良反應較小，在臨床上應用較為廣泛[5-14]。

《中國藥典》2015年版一部，通過檢測丹皮酚含量來控制復方益肝丸產品質量[15]，僅監測了牡丹皮藥材。為更好地控制復方益肝丸產品的質量，本試驗建立高效液相色譜法同時檢測復方益肝丸中大黃酸、大黃素和丹皮酚3種成分含量的方法，現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 600高效液相色譜儀(美國沃特世公司，配備Waters 2996檢測器，Waters 717plus自動進樣器，empower色譜工作站)；Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)(美國安捷倫科技有限公司)；梅特勒AB135-S微量電子天平(瑞士梅特勒科技有限公司)；Milli-Q A10純化水處理器(美國密理博科技有限公司)；KQ-2400數控超聲儀(昆山超聲波儀器有限公司)。

大黃酸對照品(含量99.3%，批號：110757-201607)、大黃素對照品(含量98.7%，批號：110756-201512)、丹皮酚對照品(含量99.9%，批號：110708-201407)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為HPLC級；磷酸為優級純；純化水為自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；檢測波長：261 nm；掃描波長：190～400 nm；流動相：0.1%磷酸水溶液(A)、乙腈(B)，梯度洗脫；洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序

2.2 溶液配制 混合對照品儲備溶液：分別取大黃酸、大黃素和丹皮酚對照品各25.0 mg，精密稱定，置于25 ml容量瓶中，加甲醇18 ml，超聲溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻；制成濃度分別為1.0 mg/ml的混合對照品儲備溶液，2～8 ℃條件儲存。

對照品溶液：取混合對照品儲備溶液適量，制成質量濃度均為6.0 μg/ml的對照品溶液。加甲醇定容至刻度，搖勻。

供試品溶液：取復方益肝丸供試品適量，研成細粉，取約0.5 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇約20 ml，超聲提取約20 min(功率300 W，頻率55 kHz)；取出放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

陰性供試品溶液：按復方益肝丸制備方法和藥材配比比例，制備缺牡丹皮和大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗 分別取“2.2”項下對照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液和空白溶液，按“2.1”項下方法分別進樣分析，記錄色譜圖。結果陰性供試品溶液色譜圖中，在所測定的丹皮酚、大黃酸和大黃素3種活性成分對應的位置無干擾，3種活性成分分離度等符合藥典要求。典型譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

2.4 線性關系考察 分別精密量取混合對照品儲備溶液適量，制成濃度分別為0.3、0.6、1.0、6.0、15.0、30.0 μg/ml的混合標準溶液，加甲醇至刻度，搖勻；取上述溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，計算各成分線性范圍和相關系數；取對照品溶液，逐級稀釋，以3倍信噪比計算檢出限。結果見表2。

表2 回歸方程、相關系數及檢出限

2.5 重復性與精密度試驗 取復方益肝丸樣品(批號：180413)，按“2.2”項下供試品溶液配制方法處理樣品，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件設置儀器，待儀器穩定后，6份供試品溶液分別進樣20 μl，計算相對標準偏差。結果測得丹皮酚、大黃酸和大黃素峰面積RSD分別為2.11%、3.08%和2.16%，表明方法重復性良好；取“2.2”項下對照品溶液，連續進樣6次，計算相對標準偏差。結果測得丹皮酚、大黃酸和大黃素峰面積RSD分別為1.08%、1.52%和0.65%，表明方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取復方益肝丸樣品(批號：180413)，按“2.2”項下供試品溶液配制方法處理樣品，按“2.1”項下色譜條件設置儀器，待儀器穩定后，分別于0、3、6、9、12、24 h，進樣20 μl，記錄色譜圖，計算相對標準偏差。

結果顯示，丹皮酚、大黃酸和大黃素峰面積RSD分別為1.25%、1.44%和0.89%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 加標回收率試驗 取復方益肝丸樣品(批號：180413)，研成細粉，取約0.5 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，精密加入“2.2”項下混合對照品儲備溶液適量，后續按“2.2”項下供試品溶液配制方法處理樣品，按“2.1”項下色譜條件設置儀器，待儀器穩定后，分別進樣分析，計算各成分加標回收率。結果見表3。

表3 回收率試驗

2.8 樣品測定 取市售復方益肝丸樣品(批號:180413、180522、181217)，按“2.2”項下供試品溶液配制方法處理樣品，按“2.1”項下色譜條件設置儀器，待儀器穩定后，分別進樣分析，外標法計算丹皮酚、大黃酸和大黃素峰含量。結果見表4。

表4 樣品中3種待測物含量(mg/g)

3 討論

3.1 波長的選擇 取丹皮酚對照品約10.0 mg，精密稱定，置200 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取上述溶液1.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，丹皮酚測試溶液濃度為5.0 μg/ml。同法配制大黃酸和大黃素測試溶液。取上述測試溶液，分別在紫外可見光譜進行波譜掃描(掃描范圍190～450 nm)。結果為在261 nm處，丹皮酚、大黃酸和大黃素吸收強度較強，因此選擇261 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 試驗考察甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液2種流動相組合體系。結果在甲醇-0.1%磷酸水溶液體系下，大黃酸和大黃素分離效果較差，且分析時間長，檢測效率偏低；在乙腈-0.1%磷酸水溶液體系下，丹皮酚、大黃酸和大黃素色譜峰分離效果較好，峰型好，符合系統適應性要求，因此，本試驗選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液體系作為流動相體系。

本試驗建立了高效液相色譜檢測復方益肝丸中活性成分丹皮酚、大黃酸和大黃素含量的分析方法，考察了分析方法的線性、重復性、精密度、加標回收率等，優化了試驗波長和流動相，結果證明，該方法具有簡單、快速、準確等優點，可以用于復方益肝丸產品的質量控制。