蛋氨酸腦啡肽抑制腫瘤的作用機制及應用前景

鄧 雷，龐曉燕，竇 磊，田東立，張 頤

0 引言

根據2017年中國最新癌癥數據顯示[1]，我國每年新發癌癥429萬例，死亡281萬例，癌癥已經成為威脅我國人民健康的一大原因。目前，癌癥治療以手術為主，放化療為輔。早期癌癥手術治療效果較好，而在晚期癌癥中，手術治療已經無法達到理想的效果，化療成為必要的治療方式之一。目前，部分化療方案不良反應較大，單一藥物化療有時無法滿足治療需要，為了達到更好的治療效果，臨床常使用聯合用藥，后者的不良反應問題引起了廣泛關注，因此，癌癥患者需要一種更加安全有效的化療方案。蛋氨酸腦啡肽(Methionine enkephalin，MENK)可以調節機體免疫系統，抑制腫瘤生長，且不良反應少，可以作為目前化療方案的佐劑。

1 MENK概述

MENK又名甲硫氨酸腦啡肽，是一種人體自分泌阿片肽，最早在1975年被Hghes發現，其結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met。MENK廣泛存在于人體的各個正常部位以及腫瘤組織中，腦組織最多，其次為腸組織。雖然分布廣泛，但MENK在正常人體內含量很低，在血漿中含量僅為50～150 pg/ml，并且在組織和血漿中迅速代謝，通常分泌后在血漿內的持續時間為20 min甚至更短。MENK生理劑量下在體內發揮重要作用。在MENK的早期研究發現，MENK廣泛存在于神經系統的各級水平和部位，因此，MENK被視為一種神經遞質，有鎮痛作用。隨著免疫學研究的不斷深入，研究顯示，免疫細胞被抗原刺激后也可產生MENK，而且MENK可以促進或抑制某些細胞因子的合成與釋放，說明MENK參與免疫調節[2]。此外，研究人員發現，MENK是一種強效的生長刺激因子，可以影響細胞增殖[3]，所以又稱MENK為阿片生長因子(Opioid growth factor，OGF)。MENK在生理濃度下可對細胞的生長起直接迅速的作用，且無細胞毒性、依賴性、耐受性及撤藥反應[4]。基于上述優點，MENK逐漸被應用于腫瘤的治療以及免疫調節，并取得了一定的成果。

2 MENK受體

2.1 MENK受體的分類及定位 經典阿片受體可分為 μ、δ、κ 3種亞型[5]，在神經細胞、免疫細胞和上皮細胞廣泛表達[6]。MENK與這些受體結合后，可以通過下調 cAMP-PKA信號通路的表達[7]、提高鈣調蛋白的含量[5]、提高中性粒細胞內蛋白激酶 C (PKC)的含量[8]等起到免疫調節的作用。1989年Zagon等[9]發現了新受體“zeta”，該受體主要調控細胞的增殖，進一步的研究表明，其與其他經典阿片受體基本不同，后更名為OGFr。早期的研究表明，OGFr是核相關受體，在細胞質沒有分布，并且在分子水平和蛋白質水平上與μ、δ、κ阿片受體幾乎沒有同源性[10-11]。阿片生長因子(OGF)-OGF受體(OGFr)軸也位于細胞的外層核膜[12]。

2.2 MENK受體的功能 中樞神經系統中μ、δ、κ 3種阿片受體均存在，可以介導痛覺傳導、調節情緒和行為等功能，同時具有成癮性。免疫系統中的阿片受體主要為δ、μ受體，廣泛存在于免疫細胞中，通過與MENK結合調節免疫功能[13]。Zagon等[9]應用免疫細胞化學技術等發現，OGFr在多種腫瘤細胞及正常細胞中皆存在，可以調節細胞的增殖。

3 MENK抑制腫瘤的機制

MENK對腫瘤的抑制作用主要通過調節機體免疫系統以及對腫瘤細胞的直接抑制和殺傷實現。

3.1 MENK通過免疫系統抑制腫瘤的作用機制 免疫系統具有監視、清除體內異常細胞的功能。MENK對免疫系統具有雙向調節作用，即高濃度時抑制免疫系統，低濃度時刺激免疫系統，促進免疫細胞的增殖[14-15]，增強其對腫瘤細胞的殺傷作用[16-17]，并且調節細胞因子的合成與釋放[18-19]，這對腫瘤的抑制和殺傷意義重大。

3.2 MENK直接抑制與殺傷腫瘤細胞的機制 有研究顯示，頭頸部鱗癌(SCCHN)組織中，OGFr 蛋白比正常上皮少90%。OGFr 蛋白在乳腺癌中表達明顯低于乳腺良性病變[20]。當施加 OGFr 特異性抗體、OGFr 拮抗劑或采用反義 OGFr RNA 干擾 OGF-OGFr 的相互作用時，腫瘤細胞倍增速度加快，細胞數量顯著增加[21]。這進一步證明了MENK對細胞生長的抑制作用是通過與 OGFr 結合實現。目前認為，MENK可以抑制腫瘤細胞的周期，且主要將腫瘤細胞抑制在G0/G1期[22]，但這并非唯一途徑。有研究表明，MENK可以抑制神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的生長，且抑制率與細胞內鈣離子濃度有關[23]。目前MENK對腫瘤的抑制機制尚未完全清楚，現對目前研究較多的腫瘤進行闡述。

3.2.1 MENK抑制黑色素瘤的作用機制 Wang等[24]研究發現，MENK可以抑制黑色素瘤的生長，阻滯黑色素瘤A375細胞G0～G1期的細胞周期進展，MENK處理后A375細胞中μ(MOR)、κ(KOR)、δ(DOR)的mRNA表達水平增加，且以δ和μ為主，故推測MENK抑制黑色素瘤的生長可能與增加的受體數量有關。此外，MENK還可以誘導A375細胞凋亡并抑制侵襲。生存素是細胞凋亡抑制劑(IAP)家族的成員，是黑色素瘤發病機制中的重要分子。MENK處理48 h后，生存素的表達為對照組的0.011倍，提示MENK可能通過抑制生存素的表達而誘導細胞凋亡。Wang等[25]隨后通過小鼠體內實驗證明，經MENK治療的小鼠，腫瘤生長延緩，腫瘤小鼠的存活率顯著提高。MENK不僅可以直接抑制黑色素瘤B16細胞的增殖和轉移，還可以通過刺激淋巴細胞亞群和細胞因子分泌來間接殺傷B16細胞，如CD3+淋巴細胞、CD4+與CD8+T細胞，并且增加細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的合成和釋放。經MENK治療后的小鼠腫瘤組織病理學形態明顯改變，腫瘤中細胞壞死增加，細胞明顯縮小，并可見核固縮，核碎裂。由于MENK能抑制黑色素瘤細胞的生長并誘導細胞凋亡，并且增強荷瘤小鼠的免疫功能，因此，MENK理論上可成為黑色素瘤患者聯合化療的輔助治療，并且可以作為黑色素瘤患者的免疫調節劑。

3.2.2 MENK抑制胰腺癌的作用機制 MENK對胰腺癌分化的不同階段均具有無差別的作用，如高分化細胞Capan-1和MIA PaCa-2細胞，中等分化程度細胞系BxPC-3，以及未分化的胰腺癌細胞系等，MENK均可明顯抑制其增殖。Zagon等[26]通過將BxPC-3人胰腺癌細胞系移植到裸鼠體內，建立了皮下移植瘤模型，來研究MENK如何抑制腫瘤發生和增殖，結果發現，經過MENK治療后的小鼠同對照組相比，腫瘤明顯減小且生存率增加，并且發現治療后的小鼠體內腫瘤細胞內的OGFr明顯增加。最重要的是，62%的OGF處理的小鼠在所有注射100%鹽水的小鼠具有可見腫瘤時沒有出現腫瘤。當OGFR被沉默后，腫瘤增長加快，給予OGF后沒有抑制作用，當分別沉默μ、δ、κ 3種受體后，對腫瘤細胞的生長無影響。這說明OGF-OGFr對胰腺癌形成和發展具有穩定的調節作用。研究發現，MENK可以通過胰腺癌細胞中的p21細胞周期抑制激酶途徑抑制腫瘤細胞DNA合成，并主要將其抑制在G0/G1期，從而降低其增殖能力[27]。因此，MENK可以作為胰腺癌的主要治療方法，并作為其他化療的佐劑途徑，現已進入臨床試驗。

3.2.3 MENK抑制肝癌的作用機制 手術、消融和肝移植是肝癌患者獲得長期生存的唯一方法，但肝癌的預后極差，其死亡率接近發病率。目前，在被切除的肝臟腫瘤細胞中已發現OGFr。Avella等[28]對3種肝癌細胞系進行研究，發現MENK可以顯著抑制肝癌細胞的增殖，且呈濃度時間依賴性，同時，通過免疫組化發現OGF和OGFr能夠互相結合，并定位于肝癌細胞的細胞質與細胞核中。當使用阿片受體拮抗劑納洛酮(NLX)后，MENK對細胞增殖的影響消失。沉默人肝癌細胞中的OGFr后，內源性和外源性OGF的抑制作用也被阻斷，給予μ、δ、κ特異的受體激動劑后，未對細胞產生顯著的抑制增殖作用，這說明肝癌細胞生長抑制特異性的內源性阿片樣物質是MENK，且MENK對各種肝癌腫瘤的抑制作用具有普遍性。MENK對肝癌的抑制作用不是通過促進細胞凋亡來實現，以往的研究表明，OGF-OGFr復合物可以進入細胞核內，誘導2種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16和p21的上調，從而導致Rb磷酸化的抑制和細胞周期G1-S期的延遲[29]，在肝癌細胞中是否也存在這一機制需要深入研究。

3.2.4 MENK抑制胃癌的作用機制 胃癌是常見惡性腫瘤之一，主要通過手術進行治療，晚期胃癌一般采用化療的方法，但療效差。唐佳運等[30]研究發現，經過MENK處理的胃癌細胞，其增殖能力受到抑制，且與MENK呈劑量依賴性和時間依賴性，通過流式細胞術發現，MENK抑制腫瘤增殖能力是通過誘導凋亡來實現。Wang等[31]通過體外實驗及小鼠成瘤實驗證實，MENK可以引起Ki67、cyclin D1、c-myc mRNA減少，通過Wnt/β-catenin信號通路，以濃度和時間依賴性的方式顯著抑制人胃癌細胞SGC7901和HGC27的生長，減少細胞集落的數量，并阻止G0/G1期的細胞周期。此外，MENK可通過上調Bax、下調Bcl-2和survivin以及激活caspase-3和PARP誘導腫瘤細胞凋亡。此外，MENK上調了SGC7901和HGC27細胞中阿片受體(OGFr)的表達。SNK7901、HGC27細胞中MENK和OGFr之間的相互作用可能對MENK的抗腫瘤活性至關重要。Wang等[32]的另一項研究表明，MENK可能通過阻斷OGFr/PI3K/AKT/mTOR信號通路而使腫瘤內的巨噬細胞從M1表型向M2表型轉化，并誘導細胞凋亡。

3.2.5 MENK抑制卵巢癌的作用機制 卵巢癌是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因，盡管早期治療的效果較好，但卵巢癌復發率高，復發后的患者僅能接受姑息治療。Donahue等[33]通過卵巢癌腹膜內異種移植小鼠模型發現，每日用MENK或低劑量阿片受體抑制劑納曲酮(LDN)處理的小鼠，腫瘤細胞內OGF-OGFr軸明顯上調，暴露于MENK或LDN后，小鼠腹腔中腫瘤結節的數量肉眼可見的顯著減少，并且這些腫瘤的累積重量被抑制。同時，Donahue指出，MENK和LDN抑制腫瘤的機制與誘導細胞凋亡無關，而與抑制腫瘤組織中DNA合成和血管生成的作用有關。以往的研究表明，OGF-OGFr軸存在于卵巢癌中，采用siRNA技術沉默OGFr，可觀察到用OGFr siRNA處理的腫瘤細胞數量增加，表明卵巢癌細胞的增殖依賴于OGF-OGFr軸，此外，MENK可以通過上調p16/p21CKI途徑來抑制細胞增殖，將腫瘤細胞抑制于G1/S期[34]。采用siRNA技術敲減p16和p21蛋白顯示，p16和/或p21蛋白誘導在OGF的抑制中是必需的[35]。Fanning等[35]對比OGF和OGFr在正常人卵巢表面上皮(HOSE)細胞、良性卵巢囊腫和卵巢癌的手術標本中的表達，結果顯示，與HOSE細胞相比，在卵巢囊腫中OGF、OGFr的蛋白水平分別降低29%和34%，在卵巢癌中分別降低58%和48%。同時通過建立SKOV-3人卵巢癌細胞過表達OGFr克隆系，與用OGF處理的野生型細胞相比，過表達OGFr的克隆系用外源OGF處理后細胞生長減少70%～85%。在進一步研究中，將過表達OGFr克隆系與野生型細胞系移植入小鼠體內，4～5 d后野生型腫瘤均可測出，而過表達的克隆系則無可測量的腫瘤，直到3周后也有無法成瘤的小鼠個體，說明內源性和外源性OGF均可抑制腫瘤的生長[36]，進一步表明OGF-OGFr內源性阿片系統可能與卵巢癌發生有關。

4 MENK聯合其他藥物對腫瘤的作用

單獨使用MENK可以達到抑制腫瘤增殖的目的，通過與其他抗腫瘤藥物合用可以增加腫瘤抑制率，并減輕抗腫瘤藥物的不良反應，降低化療藥物對免疫系統的損害。孟靜娟等[37]通過對肝癌小鼠使用MENK和注射用重組人干擾素γ(IFN-γ)，觀察聯合用藥的抗腫瘤效應，結果表明，MENK+IFN-γ能夠延長小鼠生命，并抑制腫瘤生長，效果優于其他單獨用藥組，且聯合用藥時不良反應未增多，而 IFN-γ單獨應用不能延長小鼠生命。孟靜娟等[38]還通過實驗研究MENK和IL-2對小鼠移植性瘤的抑制作用，同樣證明聯合用藥的效果好于單獨用藥。王大路等[39]研究證明，MENK和低劑量LDN都可抑制胰腺癌細胞增殖，并且均能促進體內CTL、NK和γδT細胞增殖，抑制Treg細胞的增殖，兩者合用時具有協同作用。李巖等[40]證明，MENK以及MENK聯合5-氟尿嘧啶均可抑制人肝癌HepG2細胞生長并誘導細胞凋亡，聯合用藥組抑制作用強于單獨用藥組。李彥博等[41]證明，MENK能顯著提高神經母細胞瘤SH-SY5Y對阿奇霉素的敏感性，增強其對腫瘤細胞生長的抑制作用并促進腫瘤細胞凋亡。Smith等[42]證明，OGF可能防止卵巢癌治療中單獨使用紫杉醇或順鉑后出現的全身毒性和體重減輕，同時聯用時可以增加化療藥物對腫瘤的抑制作用。結果表明，MENK聯合用藥進行免疫調節和治療腫瘤的可行性，為腫瘤治療提供了新的思路。但MENK與其他藥物之間在體內具體的相互作用，以及作用機制等仍需要進一步研究

5 展望

MENK對腫瘤的抑制和殺傷范圍廣，研究表明，OGFr存在于多種腫瘤細胞內，理論上MENK對含有OGFr的腫瘤都起作用。MENK還可以顯著恢復晚期癌癥患者受損的免疫系統，單風平[43]對21例癌癥化療后住院患者進行MENK治療發現，經過3周靜脈注射MENK治療，在治療后6個月，患者平均的NK細胞、CD4細胞、CD3細胞、T細胞以及T+B+NK細胞的數量逐漸增高，免疫功能顯著改善，說明MENK對癌癥患者免疫系統，特別是免疫功能低下的患者免疫系統的恢復有顯著作用。MENK與現有的化療藥物聯合應用還可以加強藥物的效果，提高生存率。目前MENK已經在臨床取得了一定的進展，隨著免疫學和分子生物學的不斷深入研究，MENK作用機制的不斷揭示，期待MENK成為臨床治療腫瘤疾病的有力藥物。