生物解離大豆蛋白及肽的研究進展

吳隆坤，江連洲，范志軍，王東梅，羅義

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽110034；3．黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，黑龍江佳木斯154007）

生物解離技術加工大豆是在擠壓膨化等預處理基礎上，應用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等破壞大豆細胞壁，水解蛋白與油脂的脂蛋白復合體釋放油脂，并利用油水比重、蛋白質對油和水的親和力差異，將油脂、蛋白質及其他成分進行分離，經破乳工藝制取油脂的綠色加工技術[1]。生物解離大豆工藝反應條件溫和，操作簡單、效率高、能耗低、毛油質量高、色澤淺，實現油脂與蛋白的同步提取，且油脂和蛋白的性質基本無變化，是一種新型的綠色油脂、蛋白加工工藝。大豆蛋白是生物解離制取大豆油脂的主要副產物，本文對生物解離大豆蛋白、肽的研究進行綜述，對其生產制取和生物功能特性進行了闡述，為工業生產、功能開發及科學研究提供參考。

1 生物解離大豆蛋白的研究

1.1 生物解離大豆蛋白制備工藝

生物解離即水酶法提取大豆蛋白工藝，主要在前期預處理、不同生物酶的選擇、工藝條件的優化以及結合化學改性等方面，做了相關研究，參見表1。

李楊等[2]應用5種蛋白酶進行水酶法提取大豆蛋白，確定堿性蛋白酶作為水解酶最佳條件的蛋白提取率可達到93.76%。李楊等[3]通過響應曲面分析方法確定生物解離擠壓膨化工藝最佳參數，試驗在最優工藝條件下總蛋白得率可達到94.17%左右，且擠壓膨化比濕熱預處理提取總蛋白得率提高了近15%。李楊等[4]采用4種（堿性蛋白酶、纖維酶、半纖維酶、果膠酶）的復合水酶法提取大豆蛋白，得到蛋白提取率為85.78%。劉雯等[5]將琥珀酰化與水酶法相結合，優化出最佳改性工藝參數下的總蛋白和多肽與改性前相比分別提高了4.37%和23.46%。劉雯等[6]大豆水酶法的蛋白提取在酶解過程中，利用三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）進行磷酸化改性，利用響應面分析優化出最佳改性工藝的總蛋白提取率為94.05%。李楊等[7]利用真空擠壓膨化預處理水酶法研究提取大豆蛋白工藝，最優工藝條件比傳統濕熱預處理工藝提高了近14個百分點。馬楠等[8]采用萌發預處理方法輔助水酶法提取大豆蛋白，得出萌發預處理技術可大幅提高蛋白提取率，且作用效果強于粉碎、超聲等預處理技術，在最優萌發處理工藝下，蛋白提取率高達91.91%。以上研究從蛋白質提取率角度，可以初步得出堿性蛋白酶水酶法結合擠壓膨化預處理技術，是目前生物解離提取大豆蛋白的較為合理工藝，萌發及磷酸化和琥珀酰化對蛋白提取有一定提高。

表1 生物解離大豆蛋白工藝研究Table 1 Study on the technology of biological hydrolysis soybean protein

1.2 生物解離大豆蛋白功能特性

生物解離制取大豆蛋白功能性研究可參見表2。

表2 生物解離大豆蛋白功能性研究Table 2 Study on the function of biological hydrolysis soybean protein

續表2 生物解離大豆蛋白功能性研究Continue table 2 Study on the function of biological hydrolysis soybean protein

江連洲等[9]采用超濾法回收水解液中的蛋白質，建立膜通量影響的模型，優化回收蛋白質質量分數增至88.63%，回收蛋白的溶解性升高，乳化活性和乳化穩定性指數降低，且超濾對低聚糖類物質的脫除效果較好。楊柳等[10]研究3種預處理下生物解離大豆蛋白的功能特性，得出超聲波輔助水酶法大豆蛋白的功能特性與大豆分離蛋白接近，優于大豆濃縮蛋白，且好于濕熱處理及擠壓膨化輔助水酶法大豆蛋白。陳中等[11]研究大豆蛋白的堿性蛋白酶解液在酸性條件下具有良好的穩定性，推測酶解產物間的疏水性相互作用而使酶解液形成不溶性絮凝物，使得蛋白的穩定性和溶出率下降。江連洲等[12]對體外模擬消化過程中大豆蛋白的亞基結構表征中發現，受胃蛋白酶的消化或降解行為影響蛋白的不同組分存在明顯差異。王中江等[13-14]探討熱處理條件對大豆分離蛋白體外模擬消化特性得出，伴隨加熱處理溫度的不斷升高，水解度曲線變化趨勢呈現先上升后下降，二級結構中α-螺旋結構含量變化呈先升高后降低的趨勢，而β-折疊結構含量相反為先降低后升高。王瑞等[15]用熒光光譜對大豆分離蛋白體外模擬消化過程不同時間熱處理的產物進行分析，表明熒光強度呈現出先上升后下降的變化趨勢，且熒光強度隨著加熱時間的延長，20 min時達到最大值，繼續加熱熒光強度逐漸下降。江連洲等[16]采用7種蛋白酶酶解擠壓膨化大豆粉，得出風味蛋白酶酶解產物苦味值最低，乳化活性和乳化穩定性效果最優。佟曉紅等[17]對生物解離大豆蛋白酶解物體外模擬消化抗氧化活性變化進行研究，結果表明經過模擬胃腸消化后，風味蛋白酶酶解物比堿性蛋白酶酶解物抗氧化活性更高，且肽中具有抗氧化活性的氨基酸含量更高。由表2可以得出生物解離后大豆蛋白質的分子量、蛋白結構，溶解性、乳化性、水解性均發生了一定變化，對酶解產物的體外消化模擬研究為生物解離獲取的蛋白質、肽進一步利用提供依據。

2 生物解離大豆肽的研究

大豆肽即“肽基大豆蛋白水解物”，大豆蛋白被蛋白酶水解后，再經特殊處理得到的蛋白質水解產物，具有高保濕性、發泡性、非酸沉性、無蛋白變性、加熱不凝固、消化吸收率高、易溶于水和流動性好等優加工特性，還具有降低膽固醇、降血壓和促進脂肪代謝的生理功能[18]。

2.1 生物解離大豆肽的制備

生物解離是最常用的生物活性肽生產方法，大豆肽制備的酶制劑主要有堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。周川農等[19]對木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶和中性蛋白酶4種蛋白酶進行篩選，研究制備小分子大豆肽的復合蛋白酶解最優條件。江連洲等[20]經擠壓預處理生物解離大豆得出最佳工藝條件下大豆多肽得率可達到41.36%左右，比未經擠壓膨化預處理大豆多肽得率有顯著提高。吳瑕等[21]經超聲波預處理的酶水解物亞鐵還原能力明顯強于抗壞血酸但不及丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）（P<0.05），抗氧化能力強于未經超聲波處理的酶水解物。王歡等[22]對生物解離大豆水解液富肽豆粉中蛋白類物質亞基組分研究，得出不同微波干燥條件下影響肽組分差異的原因是物相轉換率和分子間碰撞機會不同，使得蛋白纖維化聚集形成的速度不同。張巧智等[23]研究大孔吸附樹脂對水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能和純化效果，得出肽段的抗氧化性與其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量具有一定相關性。趙強忠等[24]對大豆分離蛋白胰酶酶解液對酸乳促發酵作用及增黏作用研究，得出胰酶酶解24 h后酶解液對乳酸菌的促生長作用和增黏作用最強。

2.2 生物解離大豆肽的生物活性

生物活性肽在代謝調控中起著重要的作用。本文對目前生物解離大豆生物活性肽的研究綜述，參見表3。

上述研究表明，在胃腸消化、食品加工和各種動植物蛋白質的微生物蛋白水解過程中，可以釋放出具有生物功能特性的小肽，大豆蛋白是生物活性肽的良好來源。近年來的研究發現，大豆肽具有降血壓、降膽固醇、抗氧化和抗癌等多種保健作用。

表3 生物解離大豆生物活性肽研究Table 3 Examples of biofunctional peptides derived from soybean

降血壓：采用Alcalase酶制備大豆蛋白ACE抑制肽，顯著降低自發性高血壓大鼠血壓的收縮壓[25]。劉佳等[26]制備5種血管緊張素轉化酶大豆蛋白抑制肽，其中最適酶Protease N制備肽ACE抑制率達到65.1%。M.Kuba等[27]用酸性蛋白酶水解分離大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白得到降血壓肽經過體外胃腸道模擬消化后仍有較高的ACE抑制活性。Shimakage等[28]用蛋白酶處理納豆，純化并鑒定5種ACE抑制肽（Ile-Ile、Ile-Asp、Ile-Phe-Tyr、Leu-Phe-Tyr、Leu-Tyr-Tyr）和 8 個豆漿ACE抑制肽的ACE抑制活性比未經蛋白酶處理豆漿高36倍。吳建平等[29]從堿性蛋白酶大豆蛋白水解液中分離出Asp-Leu-Pro和Asp-Gly兩種具有降血壓效果的活性肽。王升光等[30]研究菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶復合酶解制備大豆肽，肽活性片段對高血壓大鼠模型降壓作用顯著，高劑量組和降壓藥卡托普利組相當。王進等[31]用堿性蛋白酶制備的大豆玉米復配肽，ACE抑制率優于單一的玉米肽和大豆肽。孔繁東等[60]研究酶解反應體系發現大豆肽液經酸處理后，活性抑制率略有浮動，熱處理后ACE抑制活性略有提升后下降。

抗氧化：蛋白酶在水解大豆蛋白時，蛋白的空間結構被改變，氨基酸活性基團將被暴露，使得小分子的大豆肽比完整的蛋白質具有更高的抗氧化活性[61]。酶解后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白增加了3～5倍，清除自由基活性、抗氧化活性增強[62]。利用芽孢桿菌蛋白酶酶解β-伴大豆球蛋白中分離出6種抗氧化肽[32]。劉丹[33]采用微波輔助堿性蛋白酶酶解大豆濃縮蛋白粉制備抗氧化活性肽，分離純化F5組分對H2O2誘導HEK-293細胞氧化損傷的保護效果最好。García-Nebot等[34]報道大豆肽lunasin對過氧化氫和叔丁基過氧化氫誘導的人腸Caco-2細胞氧化應激具有保護作用。Zhang等[35]研究發現大豆水解蛋白SPH-I（3 kDa～5 kDa）組分對H2O2誘導人小腸Caco-2細胞氧化損傷具有保護作用，肽的保護作用可能機制是組分中SPH-I富含疏水性和抗氧化性AAs，通過抑制脂質過氧化和刺激抗氧化酶活性來保護Caco-2細胞免受H2O2誘導的氧化應激。Beermann等[36]發現食品級胰蛋白酶和糜蛋白酶水解大豆分離蛋白的抗氧化能力為113 mg TEAC/g。Zhang等對SPH肽的腸上皮轉運進行研究，用高效液相色譜串聯質譜（liquid chromatographytandemmassspe-ctrometry，LC-MS/MS）對主要吸收的肽進行了鑒定[37]，共鑒定了350種分子量范圍為813.47Da～1 982.94 Da的肽，在Caco-2細胞單層滲透液中鑒定出10種主要大豆肽。

降膽固醇：動物實驗研究表明，大豆蛋白攝入后，減少腸道對膽固醇的吸收，糞便中膽汁酸的排泄量增加，降低肝臟中膽固醇含量，提高低密度脂蛋白含量，起到降脂作用[38]。也有研究認為大豆蛋白質在胃腸蛋白酶酶解產生生物活性肽，發揮降低膽固醇作用[39]。大豆蛋白循環降低高膽固醇血癥患者的甘油三酯和膽固醇[40]。據報道，在大鼠實驗中大豆蛋白酶解肽（SPH）比完整的大豆蛋白具有較強的降低血清膽固醇的效果[41]。大豆肽與磷脂結合能共同發揮降低血膽固醇的活性，從大豆11S球蛋白分離N末端的亮氨酸殘基的四肽（lpyp），具有降低膽固醇的效果[42]。此外，Zhong等[43]研究大豆肽對小鼠模型降膽固醇作用，發現膽固醇膠束抑制率最高可達48.6%。

減肥：已經確定幾種大豆生物活性肽具有減肥的特性，如從大豆11S球蛋白亞基缺失肽的“Leu-Pro-Tyr-Pro Arc”和“Pro-Gly-Pro”被發現有抑制食欲的作用[44]。有證據表明，大豆蛋白可以影響動物的肝臟脂肪合成。膳食大豆蛋白在大鼠肝臟中能降低血漿中甘油三酯的濃度，使得肝脂肪合成酶的活性顯著降低，特別是6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸酶、脂肪酸合成酶以及乙酰輔酶A羧化酶的活性，表明大豆蛋白通過部分抑制脂肪酸在肝臟中合成，來降低肝臟甘油三酯和脂肪[63]。Jang等[45]研究黑大豆肽對飲食誘導肥胖小鼠的減肥作用，發現喂食黑大豆肽高脂肪小鼠比沒有喂食的對照組體重增長緩慢。研究發現大豆蛋白7S水解物能夠釋放CCK STC-1細胞受體從而減少大鼠食欲[46]。

免疫調節：據報道，用堿性蛋白酶制備大豆蛋白水解物、不溶性大豆蛋白水解物對小鼠脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞吞噬起到增殖作用，具有免疫調節活性[47]。張建等[48]在金黃色葡萄球菌表皮創傷感染下的負氮平衡老年小鼠的免疫調節和炎癥抑制中發現，大豆蛋白與低聚肽能顯著提高體液免疫功能，對炎癥反應和肌肉萎縮有一定抑制和恢復作用，且對早期炎癥抑制作用更加顯著。Maruyama等[49]從胰蛋白酶消化的α-β-伴大豆球蛋白亞基中分離一種具有吞噬作用的激肽。Chang等[50]研究發現用大豆肽Lunasin和細胞因子刺激共同作用的腫瘤細胞具有更高的抑制腫瘤活性。從脫脂大豆粉純化的Lunasin和其他lunasin樣肽，能夠通過抑制LPS誘導的巨噬細胞NF-κB途徑抑制炎癥[51]。

抗癌：一些流行病學和動物研究表明，大豆蛋白可以降低乳腺癌、結腸癌和前列腺癌的風險。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）通過多種機制防止癌癥，包括增加乳腺分化、對致癌物的致癌物質和信號轉導通路相關基因進行調控，使得腫瘤發生活性下降[52]。研究表明大豆lunasin抗癌潛力和作為膳食成分可能有助于乳腺癌的防治[53]。研究使用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白，不同大小分子量（＜5 kDa，5 kDa～10 kDa和 10 kDa～50 kDa）能夠抑制73%結腸癌、68%肝癌和70%肺癌細胞生長[54]。劉孝琳等[55]將大豆低聚肽（RQRK、HCGAPA）作用于HepG2細胞后，能誘導其細胞凋亡，細胞增殖受到抑制。Rayaprolu等[56]研究大豆多肽組分對血液（CCRF-CEM和Kasumi-3）、乳腺（MCF-7）和前列腺癌（PC-3）細胞增殖的生物活性，多肽組分對癌細胞的抑制率可達68.0%。這種多肽體外抑癌作用，可作為替代癌癥治療中的食品成分或營養補充劑，具有潛在的應用價值。發芽大豆與消化酶水解具有抑制脂肪細胞的增殖，促進脂肪分解作用，對人宮頸癌細胞（Hela）增殖的影響，發芽大豆粉水解蛋白有更高的抗氧化能力和改進的抑制炎癥標記物[57-59]。

大豆多肽因其具有生物功能活性而成為研究新藥物和功能性食品成分，對其促進腸道健康、調節腸道營養吸收以及對特定的靶器官發揮作用的研究逐漸深入，今后的研究還需要從分子水平研究生物活性肽發揮其作用的機制和肽在醫療方面的作用[18]。大豆生物活性肽工業生產方面上，研究開發生產、分離、提純和規模化過程中，開發簡單、成本效益高的方法，以滿足市場需求，促進生物活性肽產業發展。

3 結語

生物解離法可以同時提取油和蛋白粉，并且設備投資少、能源消耗低、廢棄物易處理，綠色安全，具有很高的利用價值和開發前景。盡管目前生物解離法提取蛋白質和生產生物活性肽還存在一些問題，如成本高、酶資源少、易失活、產生苦味肽等問題，但隨著生物工程、酶工程技術不斷發展，這些問題將會得到逐步解決。生物解離大豆蛋白今后需要進一步研究的內容包括：蛋白提取率的最佳酶解工藝參數的優化，蛋白回收、純化工藝的改進，生物活性肽的分離、功能鑒定、作用機制等。生物解離法制備蛋白、肽技術，是一種具有廣闊發展前景的技術，是未來蛋白工業的發展方向之一。