Nrf2點突變穩轉肺癌細胞株構建及鑒定

張琳琳，賈 維*，鄭翠俠

（1.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院，上海 200082；2.上海市楊浦區中心醫院，上海 200082）

關鍵字：Nrf2；點突變；肺癌；逆病毒載體

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居世界第一。大量研究表明，Nrf2-ARE信號通路在肺癌發生發展中具有重要作用。Keap1在細胞質中以二聚體形式與Nrf2結合，使之成為E3泛素連接酶的適配底物，促進Nrf2泛素化降解，進而被26S蛋白酶體降解，使Nrf2處于一種非活性狀態。當受到外界有害刺激及氧化應激時，Nrf2與Keap1解離和釋放，同時減弱Keap1介導的蛋白酶對Nrf2的降解作用[1]。Nrf2進入細胞核內增多，并與Maf蛋白形成異二聚體，啟動Nrf2下游II相解毒酶和抗氧化蛋白等靶基因的轉錄與表達，發揮細胞解毒及清除有害物質的能力[2]。但Nrf2持續性異常活躍又有助于癌細胞生長，降低其對化療藥物的敏感性[3]。在人類肺癌組織中存在Nrf2突變，該突變可使Keap1-Nrf2/ARE通路異常活化，使Nrf2蛋白表達高于基礎水平，與臨床上肺癌患者的不良預后相關[4]。本實驗利用逆病毒系統，構建Nrf2點突變穩轉細胞株，為進一步研究Nrf2基因突變在肺癌中的作用提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 人肺腺癌細胞株A549、人胚腎細胞株293T（上海中科院）；pMSCV逆病毒載體及包裝質粒gag-pol、pVSVG（本課題組實驗室）；限制性內切酶、載體連接試劑盒Ver.2.1、GXL長鏈高保真試劑盒（寶日醫生物工程有限公司）；DNA純化試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）；DH5a感受態細胞、定點誘變試劑盒、pGEM-Teasy載體（北京全式金生物技術有限公司）；Lipofectamine?2000試劑、氨芐抗生素培養基及平板、Opti-MEM培養液（美國Invitrogen公司）；高糖培養基DMEM/F12培養基、Ham’s F-12K（Kaighm’s）培養基、高糖 DMEM培養基、胎牛血清和胰酶（上海源培生物科技有限公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 Nrf2-Teasy質粒構建 利用Trizol法提取293T細胞總RNA并反轉錄為CDNA。以CDNA為模板通過PCR方法擴增Nrf2目的基因。Nrf2引物如下：Nrf2-F:5’-ATGGATTTGATTGACATACTTTGG-3’Nrf2-R:5’-CTAGTTTTTCTTAACATCTGGCTTCTTA-3’擴增產物行1.2%瓊脂糖核酸電泳，紫外燈下切膠回收目的條帶。PCR割膠回收產物加poly A尾后用10×ligase buffer 4 ℃過夜與Teasy載體連接。利用熱激法將連接產物轉化DH5α 感受態，而后在固體LB培養板上培養過夜，挑單克隆，37 ℃、220 r/min培養過夜，菌液小抽后將分子量大小正確的質粒送去測序。

1.2.2 Nrf2-MUT-Teasy（突變型Nrf2）質粒的構建 用全式金的Fast Mutagenesis System對Nrf2進行定點誘變，使其第2號外顯子有T35C和G37A的點突變。

上游引物：

下游引物：

DMT消化PCR產物，37 ℃孵育1 h。轉化過夜，挑克隆，搖菌，小抽，送測序。

1.2.3 構建pMSCV-Nrf2-T35C-3f lag，pMSCV-Nrf2-G37A-3f lag逆病毒質粒 以構好的Nrf2-Teasy質粒為模板，設計Xho1和Hpa1雙酶切引物，PCR擴增點突變的Nrf2基因。

上游引物：

下游引物：

目的片段與pMSCV載體同時做雙酶切，連接轉化，小抽后做雙酶切跑膠鑒定，把分子量大小正確的質粒送測序。

1.2.4 逆病毒的包裝與轉染 選擇對數生長期且狀態良好的293T細胞，計數細胞，每6 cm培養皿中接種3×105個細胞，培養箱（37 ℃，5% CO2）中培養過夜。將上述慢病毒表達載體3 μg、gag-pol 3 μg和p-VSVG 2 μg，加入不含血清和抗生素的250 μL opti-MEM溶液中；另取不含血清和抗生素的250 μL opti-MEM中加入16 μL Lipofectamine2000，室溫靜置 5 min。均勻混合2種液體，室溫靜置20 min后逐滴加入培養皿中。轉染6 h后換成完全培養基，48 h后收病毒。將4 mL病毒液與1 mL正常培液加入8 μg/μL的poly-brene混勻，加入A549肺癌細胞，感染8 h后換液，48 h后puro藥篩，得到穩定感染細胞。

1.3 RT-PCR檢測目的基因的表達量 提取細胞樣品中的總RNA，反轉錄為CDNA。樣品中目的基因和內參基因的表達量采用RT-PCR檢測。分析RT-PCR反應曲線，獲得各個樣品目的基因和內參基因的域值循環數（ct值）相對定量后采用△△CT計算。參照樣品為未感染逆病毒的靶細胞。目的基因的引物序列(5＇to 3＇) 如下：

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件，計量資料用t檢驗進行2組獨立樣本比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組載體鑒定 Nrf2-Teasy質粒轉化感受態細胞后，挑取單個菌落進行聚合酶鏈式反應鑒定，陽性克隆條帶大小為1 770 bp，進行DNA測序，測序結果為測通。使用測序峰圖閱讀器Chromas軟件鑒定測序結果，結果（圖1），目的基因正確插入Teasy載體。

圖1 重組Nrf2-Teasy質粒鑒定

2.2 質粒鑒定 構建pMSCV-MUT-3f lag重組質粒后，進行PCR鑒定，陽性轉化子PCR產物大小為1.7 kb，結果顯示目的條帶位置正確（圖2）。酶切鑒定：重組質粒經Xho1和Hpa1雙酶切鑒定后，在1.7 kb處可見到目的基因Nrf2片段，在7.6 kb處可見到pMSCV片段,與預期一致。從重組逆病毒樣品中可以檢測到Nrf2的條帶，表明目的基因已成功整合在病毒基因組中（圖3）。將重組質粒進行測序，并與GenBank中Nrf2序列比對驗證，結果點突變與預期相符，表明重組質粒已構建成功（圖4）。

圖2 Nrf2點突變基因片段

圖3 pMSCV-MUT-Nrf2重組質粒

圖4 兩質粒測序峰圖

2.3 穩轉株鑒定 將pMSCV-MUT-3f lag病毒包裝后感染293T細胞，熒光顯微鏡見熒光表達結果較強（圖5）。細胞內觀察到明顯熒光，說明目的質粒轉染正常，熒光標記基因表達正常。將病毒液感染A549細胞48 h后GFP的表達情況（圖6），表示Nrf2蛋白可以在A549細胞中表達。

圖5 熒光顯微鏡下觀察質粒轉染 293T細胞后GFP的表達（100×）

圖6 逆病毒感染A549人肺癌細胞（200×）

2.4 RT-PCR檢測目的基因mRNA的表達水平 將病毒液加入A549細胞，獲得穩定感染的A549肺癌細胞。轉染后提取細胞內總RNA，利用RT-PCR法檢測Nrf2 mRNA的表達水平，所得結果與Nrf2野生型（wt）相比較，可見基因突變組Nrf2基因表達豐度與對照組相比明顯升高（圖7），差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖7 轉染后各組細胞Nrf2 mRNA相對表達量（P ＜0.05）

有多項研究表明在肺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌[5-8]等腫瘤組織中Nrf2表達水平較高，Nrf2的異常激活可引起Nrf2在癌細胞中的積聚，導致Nrf2下游產物增多。Nrf2下游基因的過表達可增強癌細胞抗損傷作用，降低其對化療藥物如依托泊苷、卡鉑、順鉑、5-氟尿嘧啶和多柔比星的敏感性[9-10]。Nrf2/Keap1的體細胞突變是使Nrf2異常激活的主要途徑。突變均存在于Nrf2和Keap1相互作用的Neh2域附近或內部[11-12]。在生理情況下，Nrf2通過與Keap1結合而保持轉錄活性，并可及時被泛素蛋白酶系統降解。當突變發生，影響到Keap1與Nrf2的結合位點時，可造成Nrf2-Keap1通路活性增強，突變的細胞可從被過度激活的該途徑中獲益，以逃避內源性的腫瘤抑制作用[13-14]。

本研究通過定點誘變及逆病毒方式構建A549穩轉細胞株，而后應用熒光顯微鏡和RT-PCR方法檢測Nrf2基因在靶細胞中的表達。通過測序結果顯示，Nrf2突變位點正確，表明Nrf2突變逆病毒質粒構建成功。進而將測序無誤的質粒，構建A549穩轉細胞株，通過RT-PCR檢測Nrf2表達量，結果顯示突變組細胞Nrf2表達量顯著高于wt對照組，說明本研究制備的Nrf2點突變逆病毒穩轉細胞株構建成功。其將為深入研究Nrf2突變在肺癌發病中的作用以及調控機制奠定基礎。