黃連解毒湯聯(lián)合頭孢他啶治療小鼠銅綠假單胞菌肺炎

車路陽，趙曉東，陳麗萍，李晶哲

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心急救部，北京 100037；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100007）

銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa，PA），舊稱綠膿桿菌，是院內(nèi)感染的最常見條件致病菌，在長期使用抗生素的高齡患者及其他免疫力低下患者中具有較高感染率[1-3]。目前，銅綠假單胞菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，且耐藥譜呈現(xiàn)逐年遞增趨勢[4-7]，PA引起的下呼吸道感染特別是銅綠假單胞菌肺炎（PAP）遷延難愈，病死率高[5,8]，加之易產(chǎn)生耐藥菌株，治療難度大，是臨床高度關(guān)注和亟待解決的急癥。

目前下呼吸道銅綠假單胞菌感染常使用化學(xué)合成抗生素進(jìn)行聯(lián)合治療[9-10]，但銅綠假單胞菌廣泛耐藥性，加之長期應(yīng)用抗生素引起的菌群失調(diào)和肝腎損害等不良反應(yīng)。復(fù)合中藥方劑可從多種途徑發(fā)揮抗菌作用[11-14]。黃連解毒湯最早記載于《肘后備急方》，方劑以黃連為君，黃柏為臣，配以黃芩、梔子，通泄三焦之火，是清熱解毒的代表方?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃連解毒湯具有抗炎[15]，控制血糖[16]，降血脂改善動(dòng)脈粥樣硬化[17]等功效。在前期細(xì)菌體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)黃連解毒湯草藥的提取物對銅綠假單胞菌生長具有抑制作用。而在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯全方劑對改善細(xì)菌性肺炎患者喘憋、呼吸困難等癥狀具有良好作用；且與單獨(dú)使用抗生素的患者相比，聯(lián)合應(yīng)用黃連解毒湯的患者的白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白（CRP）等感染、炎癥指標(biāo)明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有文獻(xiàn)研究表明，黃連解毒湯聯(lián)合抗菌藥物能夠降低體外殺滅PA抗菌藥物使用濃度[18]。本研究旨通過小鼠模型探究黃連解毒湯的抗銅綠假單胞菌機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa O1，ATCC.PA15692）。8周齡BABL/c小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。LB培養(yǎng)基（Merck?VetecTM），MH培養(yǎng)基（Merck? VetecTM）。PA菌液接種至LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h，取出菌液調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫却?。黃連解毒湯藥材（黃連、黃柏、黃芩、梔子）購于同仁堂，過濾滅菌制成原液，以黃連計(jì)1 280 mg/mL；麥?zhǔn)蠞岫扔?jì)（中國食品藥品檢定研究院），細(xì)胞因子試劑盒（BD552364,BD Biosciences,USA），細(xì)菌總RNA提取試劑盒（天根DP430），Reverse Transcription System（A3500,Promega,USA），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201,TOYOBO,Japan）。

2.2 黃連解毒湯對銅綠假單胞菌相關(guān)基因的影響

2.2.1 最低抑菌濃度MIC測定 黃連解毒湯、頭孢他啶以MH培養(yǎng)基按照倍比稀釋法分別加入96孔板，每孔50 μL，每組8個(gè)復(fù)孔。通過前期工作經(jīng)驗(yàn)，黃連解毒湯（1 280 mg/mL，以黃連計(jì)）、頭孢他啶（1 024 μg/mL）配制初始濃度母液，以MH培養(yǎng)基倍比稀釋11個(gè)濃度，每孔50 μL。0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊你~綠假單胞菌液用MH培養(yǎng)基稀釋100倍后加入上述96孔板，每孔50 μL?？瞻捉M為稀釋后的菌液和不含藥MH培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)16 h后觀察細(xì)菌抑制狀況，確定黃連解毒湯和頭孢他啶的最低抑菌濃度。

2.2.2 黃連解毒湯對mucA、mraY、algD基因的影響 根據(jù)MIC值確定黃連解毒湯和頭孢他啶濃度作用于銅綠假單胞菌，使用MH培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)6 h及16 h后提取細(xì)菌總RNA，RT-PCR測定。引物序列見表1。藥物分組：空白、頭孢他啶、黃連解毒湯及黃連解毒湯加頭孢他啶。

表1 引物序列

2.3 黃連解毒湯對小鼠銅綠假單胞菌下呼吸道感染的治療

2.3.1 銅綠假單胞菌下呼吸道感染小鼠模型的建立 96只同窩8周齡BABL/c小鼠SPF環(huán)境飼養(yǎng)。小鼠隨機(jī)分為4組（A.空白組，B.頭孢他啶組，C.黃連解毒湯組，D.黃連解毒湯加頭孢他啶組），各組雌雄各12只。無菌術(shù)條件下小鼠麻醉后，頸前切開暴露氣管，其中B、C、D組向氣管內(nèi)注入0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腜A菌液10 μL，A組注入無菌生理鹽水10 μL，縫合各層組織。

2.3.2 藥物治療與觀察 通過前期實(shí)驗(yàn)和查閱資料，黃連解毒湯對小鼠細(xì)菌感染基本治療濃度是700 mg/kg（以黃連計(jì)）[19]，頭孢他啶對小鼠PA感染的治療濃度是65 mg/kg[20]，黃連解毒湯與頭孢他啶分別配制為1 500 mg/mL與500 mg/mL的母液。按體質(zhì)量計(jì)算藥液量，黃連解毒湯、頭孢他啶均灌胃給藥?？瞻捉M使用滅菌生理鹽水代替藥物。

2.3.3 組織病理檢查與血液檢查 于第3、第5天取小鼠全血，以抗凝管收集血液1 mL，CBA法測定細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6/10/12p70）。于第3、第10天解剖獲取肺組織，制作石蠟切片，觀察組織變化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 MIC值的測定 藥物梯度96孔板培養(yǎng)16 h后觀察細(xì)菌濁度，黃連解毒湯160 mg/mL（以黃連計(jì)）、頭孢他啶8 μg/mL時(shí)，細(xì)菌生長被抑制。黃連解毒湯和頭孢他啶的MIC分別為160 mg/mL和8 μg/mL。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以這2個(gè)濃度為基礎(chǔ)。

3.2 聯(lián)合用藥 可以抑制mucA、mraY、algD等基因的表達(dá) 。如表2（培養(yǎng)6 h）和表3（培養(yǎng)16 h）所示，黃連解毒湯加強(qiáng)了頭孢他啶對mraY表達(dá)的抑制作用。同時(shí)，與黃連解毒湯共培養(yǎng)后明顯抑制了mucA和algD基因的表達(dá)，并且在與頭孢他啶聯(lián)合用藥后，上述兩基因的表達(dá)抑制更加明顯（P＜0.05），頭孢他啶能夠加強(qiáng)黃連解毒湯對mucA和algD兩種基因表達(dá)的抑制。數(shù)據(jù)為至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

表2 mucA、mraY、algD表達(dá) （第6小時(shí)取樣測定）（，n =3）

表2 mucA、mraY、algD表達(dá) （第6小時(shí)取樣測定）（，n =3）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；## P ＜0.01

表3 mucA、mraY、algD表達(dá) （第16小時(shí)取樣測定）（，n =3）

表3 mucA、mraY、algD表達(dá) （第16小時(shí)取樣測定）（，n =3）

注：與空白組比較，### P ＜0.001

3.3 銅綠假單胞菌下呼吸道感染小鼠模型的治療實(shí)驗(yàn)

3.3.1 聯(lián)合用藥可以降低血液中炎性因子群的含量 PAP小鼠治療實(shí)驗(yàn)，在第3、第5天各治療方案血液炎性因子檢測結(jié)果分別如表4、表5所示。取樣的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用頭孢他啶或黃連解毒湯治療相比，兩者聯(lián)合用藥治療后，各取樣時(shí)間點(diǎn)血液中TNF-α，IFN-γ，IL-6/10/12p70等炎性因子下降效果顯著。且黃連解毒湯組的TNF-α、IL-6、IL-10等指標(biāo)顯著低于頭孢他啶組。黃連解毒湯具有輔助頭孢他啶進(jìn)行抗炎治療的作用。

表4 血漿炎性因子群的表達(dá)（3 d）（，n =3）

表4 血漿炎性因子群的表達(dá)（3 d）（，n =3）

注：與頭孢他啶組或黃連解毒湯組比較，# P ＜0.05；與頭孢他啶組比較，△P ＜0.05

表5 血漿炎性因子群的表達(dá)（5 d）（，n =3）

表5 血漿炎性因子群的表達(dá)（5 d）（，n =3）

注：與頭孢他啶組或黃連解毒湯組比較，# P ＜0.05；與頭孢他啶組比較，△P ＜0.05

3.3.2 聯(lián)合用藥可以加快肺組織腫脹恢復(fù)和炎癥消退 小鼠肺臟不同時(shí)間點(diǎn)石蠟切片HE染色結(jié)果圖1所示，由圖可見，單獨(dú)應(yīng)用黃連解毒湯治療，與頭孢他啶相比，第3天時(shí)肺泡間隔腫脹略嚴(yán)重，但炎細(xì)胞浸潤更少。而聯(lián)合用藥組在第10天時(shí)組織腫脹和炎細(xì)胞浸潤均優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用頭孢他啶組，肺泡形態(tài)基本接近陰性對照（正常）。

4 討論

圖1 小鼠PA感染肺石蠟切片HE染色

黃連解毒湯作為清熱解毒的中藥經(jīng)典方劑。PA肺炎小鼠模型治療實(shí)驗(yàn)中，與單純使用頭孢他啶相比，黃蓮解毒湯聯(lián)合頭孢他啶治療后，小鼠血液中炎性指標(biāo)明顯下降，肺組織腫脹和炎細(xì)胞浸潤程度明顯減輕且恢復(fù)較快。聯(lián)合用藥組小鼠進(jìn)食、飲水及其他活動(dòng)明顯多于其他組。說明黃連解毒湯對小鼠PA下呼吸道感染具有治療作用。

研究表明，黃連解毒湯方劑能有效抑制IL-2、TNF-α、IFN-γ 等炎性因子的形成[21]，其內(nèi)梔子苷、黃芩苷等單藥有效成分亦有一定的抗炎作用[22]。有研究認(rèn)為，抗炎作用可能是通過調(diào)節(jié)相關(guān)代謝產(chǎn)物和酶，從而影響巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)[23]。本研究中，PA肺炎小鼠通過單獨(dú)使用黃連解毒湯治療，其中一些炎性因子例如TNF-α，IL-6/10等甚至低于單純抗生素治療組。前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，無論藥物治療還是自然病程，在第3天時(shí)血液炎癥指標(biāo)達(dá)到最高峰。聯(lián)合用藥組中，第5天時(shí)，各種炎性指標(biāo)明顯低于單獨(dú)用藥組，肺組織切片中，單獨(dú)應(yīng)用黃連解毒湯或與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用，在10天時(shí)肺部炎細(xì)胞浸潤少于單獨(dú)應(yīng)用頭孢他啶組。這些現(xiàn)象證明黃連解毒湯本身具有抗炎作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21-23]。而且這種抗炎作用能夠加強(qiáng)頭孢他啶的治療效果，這對于促進(jìn)呼吸困難、喘憋等炎性浸潤癥狀的緩解，特別是改善高齡患者預(yù)后具有重要意義。

銅綠假單胞菌（PA）是假單胞菌屬的代表菌，其特征是需氧有鞭毛，無芽孢，無莢膜。引起PA產(chǎn)生多重耐藥的機(jī)制主要包括：1）分泌β-內(nèi)酰胺酶等蛋白酶類降解抗生素；2）通過增加主動(dòng)外排藥物和減少膜孔蛋白等方式降低細(xì)胞膜通透性，使藥物難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；3）藥物作用位點(diǎn)突變，使藥物作用位點(diǎn)（如氟喹諾酮類殺菌重要位點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶II）不再能與藥物穩(wěn)定結(jié)合；4）生物膜的形成[9,24]。

為研究黃連解毒湯對PA的抗菌作用和可能機(jī)制，根據(jù)我們的前期研究以及查閱相關(guān)資料，選擇了觀察mucA、mraY、algD等3種基因在治療過程中的表達(dá)狀況。磷酸-N-乙酰胞壁酸酯-胸腺噴丁轉(zhuǎn)位酶（mraY）是PA細(xì)胞壁主要成分肽聚糖合成的重要酶，可作為細(xì)胞壁合成的標(biāo)志[25-26]。mucA基因與PA菌生物膜形成[24,27]、特別是生物膜重要成分藻酸鹽合成[28]相關(guān)。algD基因則是與PA藻酸鹽合成相關(guān)的直接基因[29-30]，處于mucA基因下游，有文獻(xiàn)報(bào)道，mucA基因突變可導(dǎo)致algD基因表達(dá)去阻遏，藻酸鹽過量表達(dá)[31]。因此，algD與mucA基因一起，可作為PA生物膜形成的標(biāo)志物。

生物膜是包被于外界物體表面（在本實(shí)驗(yàn)中是包被于感染的肺組織之外）的復(fù)雜細(xì)菌組織，包括實(shí)現(xiàn)復(fù)雜物質(zhì)互通的細(xì)菌群落及其分泌的蛋白質(zhì)、多糖、肽聚糖等形成的覆蓋于其表面的復(fù)雜黏液被膜。生物膜具有復(fù)雜的代謝過程，對于抗生素和受感染宿主的本身免疫反應(yīng)具有很強(qiáng)的抵抗力，破壞生物膜的穩(wěn)定性能夠大大減少細(xì)菌的耐藥程度[32-33]。

頭孢他啶是第三代頭孢菌素，其殺菌原理和其他β-內(nèi)酰胺類抗生素一致，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。藥物共培養(yǎng)試驗(yàn)可見。頭孢他啶組mraY基因表達(dá)明顯下降，殺菌原理與文獻(xiàn)報(bào)道一致[34]。而黃連解毒湯與PA菌共培養(yǎng)后，無論是否聯(lián)合頭孢他啶，mucA、algD兩組基因表達(dá)均較陰性、陽性對照組明顯下降。證明黃連解毒湯能夠通過抑制藻酸鹽的合成從而破壞PA細(xì)菌生物膜的形成，達(dá)到殺菌的作用。

黃連解毒湯對PA下呼吸道感染小鼠具有治療作用，該方能夠通過破壞PA細(xì)菌生物膜的穩(wěn)定性起到殺菌作用，聯(lián)合頭孢他啶使用時(shí)明顯增強(qiáng)抗菌效果；同時(shí)能夠通過抗炎作用，緩解PA感染帶來的機(jī)體炎癥反應(yīng)，促進(jìn)癥狀緩解，減少病死率。