散結通脈方對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化主動脈鈣庫操縱性鈣通道信號分子及血清炎癥因子的影響

丁云錄，李馳坤，歐喜燕，李曉兵，成光宇，劉愛東

（長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以血管壁脂質斑塊為主要特征的慢性進行性血管疾病，其引發冠心病、腦梗塞等急性心腦血管事件而嚴重危害人類健康。中藥在治療動脈粥樣硬化慢性病變方面有明顯優勢，中藥作用溫和持久，毒副作用低，且作用機理具有多效應、多位點等特點，遠期效果好。散結通脈方針對冠心病痰瘀互結證進行治療，體現化瘀清痰利水動態治療思想，前期的臨床實踐發現，該處方具有逆轉和消退動脈粥樣硬化斑塊的作用。拓展了中醫防治動脈粥樣硬化的新思路，并為臨床治療提供實驗依據和安全有效的中醫藥療法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級7～8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，體質量（20±1）g，60只，分籠飼養，室溫（23±1）℃，相對濕度50%，通風良好，室內12 h明暗自動切換（光照時間7:00～19:00）。動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。散結通脈方浸膏（處方由丹參、水蛭、三七、花蕊石、茵陳、澤瀉、茯苓、砂仁、檀香等14味藥組成），性狀：棕褐色至棕色浸膏，氣微，味苦，批號：20180329，長春中醫藥大學附屬醫院實驗研究中心提供。阿托伐他汀鈣片，規格：10 mg/片，7片/盒，批號：20171221，浙江新東港藥業股份有限公司產品。戊巴比妥鈉，規格：500 mg/瓶，批號：WXBB6772V，美國Sigma公司產品。肝素鈉注射液，規格：2 mL/12 500 u/支，批號：1702101，上海上藥第一生化藥業有限公司。膽固醇，規格：分析純，500 g/瓶，批號：LOT5AF10250，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；膽酸鈉（豬），規格，分析純，500 g/瓶，批號：K01N8B47111，上海源葉生物技術有限公司產品。總膽固醇（TC）檢測試劑盒，規格：10 mL×10，批號：171991；三酰甘油（TG）檢測試劑盒，規格：10 mL×10，批號：177781；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-cho）檢測試劑盒，規格：10 mL×7，批號：170651；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-cho）檢測試劑盒，規格：10 mL×8，批號：170711；中生北控生物科技股份有限公司產品。高敏C-反應蛋白（hs-CRP）、E-選擇素（E-selectin）、白細胞介素-6（IL-6），規格：96T/盒，批號：E20180101A，均購自美國RD公司。Orai1抗體，規格：200 μg/mL，批號：D2318，STIM1抗體，規格：200 μg/mL，批號：K2818，均為Santa Cruz公司產品。美國UVP凝膠成像系統，型號：ChemiDoc-It 510 Imager，Ultra-Violet Products Ltd產品。電泳儀，型號：DYY-6C,北京市六一儀器廠產品。酶標儀，型號：BIO680，Japan BIO RAD公司產品。Junior全自動分析儀，型號：selectra junior，荷蘭威圖公司產品。臺式高速低溫離心機，型號：Biofuge Stratos，德國賀利氏公司產品。可調高速勻漿器，型號：FSH-2，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產品。

1.2 方法[1-5]

1.2.1 動物造模與分組 選用8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60只。小鼠給予普通飼料適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照藥阿托伐他汀鈣49.72 mg/（kg·d）給藥劑量組，散結通脈方設高劑量[13.42 g/（kg·d）]、中劑量[6.71 g/（kg·d）]和低劑量[3.35 g/（kg·d）] 3個給藥劑量組，共6組，每組10只。建立動脈粥樣硬化斑塊模型，除正常對照組外，其余實驗組均飼以高脂飼料（2%膽固醇、0.4%膽酸鹽、10%脂肪、69.6%普通飼料）喂養12周。實驗期間自由攝食飲水，節律光照。造模同時灌胃供試藥品混懸液，正常對照組及模型對照組灌胃蒸餾水。每3日稱量各組小鼠體質量1次，以調整給藥量。

1.2.2 檢測指標 實驗周期結束，禁食12 h，1%戊巴比妥0.5～1.0 mL腹腔麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，進行血脂及血清炎癥因子檢測。取血結束后，以肝素生理鹽水灌洗心臟及主動脈根部，無菌條件下取主動脈根部，制備蛋白裂解液，進行Western blot檢測。檢測指標：Junior全自動分析儀檢測血清TC、TG、HDL-cho和LDL-cho水平。BIO680酶標儀檢測 hs-CRP、E-selectin、IL-6水平，均采用酶聯免疫法按試劑盒說明檢測。Western blot法檢測主動脈根部Orai1及STIM1蛋白表達：BCA法測定蛋白濃度，調整蛋白濃度，煮沸3～5min使蛋白變性；SDS-PAGE電泳，轉膜；轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到1×TBST中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉膜液；加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min；TBST稀釋一抗（1:1 000），4 ℃孵育過夜；加入1×TBST，在搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min，共洗滌3次；TBST稀釋二抗(1:3 000)，室溫孵育60 min；TBST洗膜3次，每次5～10 min；ECL化學發光，顯影，定影。用Quantity One軟件對凝膠圖像進行光密度分析，以目的條帶與內參照條帶信號強度的比值代表組織中目的蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 血脂摩爾濃度統計結果 本試驗研究采用喂飼高脂高膽固醇飼料方法建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，從建立模型12周后所測得的試驗數據可以看出，動脈粥樣硬化模型組動物血清TC、TG、LDL-cho及TC/HDL-cho比值均較正常對照組明顯升高（分別為P＜ 0.01或P＜0.05），動脈粥樣硬化動物模型血脂水平明顯增高。散結通脈方13.5、6.75和3.40 g/kg 3個給藥組具有明顯降低模型動物血清TC、TG和LDLcho水平的作用，與動脈粥樣硬化模型組比較，分別為P＜ 0.01或P＜0.05，散結通脈方13.5、6.75 g/kg 2個劑量組還可以使TC/HDL-cho比值明顯降低，與動脈粥樣硬化模型組比較，P＜0.01和P＜0.05。見表1。

2.2 hs-CRP、E-selectin、IL-6質量濃度統計結果 模型對照組與正常對照組比較，大鼠血清中hs-CRP、E-selectin、IL-6水平明顯升高，具有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。而13.5、6.75 g/kg 2個劑量組與模型對照組比較，大鼠血清中hs-CRP水平均有所下降，具有統計學意義（均P＜0.05）。結果表明散結通脈方可以對抗動脈粥樣硬化患者體內炎癥反應，降低hs-CRP水平，進而可起到抗心肌缺血降低心血管事件發生率的作用。與模型組相比，散結通脈方13.5 g/kg劑量組血清IL-6水平明顯低于模型組，具有統計學差異（P＜0.05），說明散結通脈方有效降低ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的IL-6水平，從而抑制炎癥、穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用。散結通脈方13.5 g/kg劑量組E-selectin水平明顯降低，與模型對照組比較，具有統計學差異（P＜0.05），提示散結通脈方可能通過下調E-selectin水平，減少白細胞在內皮表面的黏附，進而減少泡沫細胞的形成，延緩了動脈粥樣硬化的形成。見表2。

2.3 主動脈根部Orai1、STIM1蛋白表達統計結果 我們以ApoE-/-小鼠為實驗對象，高脂飲食誘導動脈粥樣硬化模型，探討動脈粥樣硬化發生過程中Orai1、STIM1變化情況，研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組Orai1、STIM1蛋白表達明顯增加（P＜0.01），提示：Orai1、STIM1介導的SOCC參與了動脈粥樣硬化的發生發展過程。在給予散結通脈方干預后，與模型組相比，散結通脈方13.5、6.75 g/kg 2個劑量組主動脈根部Orai1、STIM1蛋白表達明顯低于模型組，具有統計學差異（P＜0.01或P＜0.05）；散結通脈方3.40 g/kg劑量組主動脈根部Orai1蛋白表達明顯低于模型組，具有統計學差異（P＜0.05）。見表2。

表1 散結通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型血脂的影響（，n =10）

表1 散結通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型血脂的影響（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 散結通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型炎癥因子及Orai1、STIM1蛋白表達的影響（，n =10）

表2 散結通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型炎癥因子及Orai1、STIM1蛋白表達的影響（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化是導致冠心病的主要病因，中醫沒有動脈粥樣硬化病名，根據臨床表現，將動脈粥樣硬化性疾病歸為胸痹、脈痹范疇。西醫治療冠心病以藥物治療為主，側重于穩定冠狀動脈粥樣硬化斑塊，常見的藥物不良反應包含出血事件、肌肉酸痛、胃腸道反應等影響了治療的效果。中藥在治療動脈粥樣硬化慢性病變方面有明顯優勢，中藥作用溫和持久，毒副作用低，且作用機理具有多效應、多位點等特點，遠期效果優秀。國家名老中醫黃永生教授綜合古代醫家對于痰瘀的論述及自己多年的臨床實踐，根據《血證論》：“血積既久，亦能化為痰水”的論述，提出“瘀能化水”治療動脈粥樣硬化的新思路。他認為動脈粥樣硬化的治療重點為斑塊的逆轉和消退，動脈粥樣硬化斑塊為痰瘀膠結的外在體現，是痰瘀長時間膠結凝聚的產物，痰結成瘀，瘀又生痰，不斷進展和演化，痰不清，瘀難化。因此，治療上需以化痰開路，將痰濁之邪蕩滌體外，繼以化瘀成水（痰），消散斑塊。散結通脈方為全國名中醫黃永生教授臨床經驗方，臨床使用逾20年，療效確切，臨床依據充分，本方逆轉冠狀動脈粥樣硬化斑塊有確切的療效，具有進一步開發與研究的價值和意義。本課題通過建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，從主動脈鈣庫操縱性鈣通道信號分子STIM1、Orai1蛋白表達及血清hs-CRP、E-selectin、IL-6含量等方面探討痰瘀同治法穩定易損斑塊的可能機制。

TC和TG是血漿中的主要脂質成分，脂質成分的異常能夠導致動脈粥樣硬化的形成并促進其發展[6]，LDL-cho是體內膽固醇代謝轉運的主要載體，研究表明，LDL-cho的水平與動脈粥樣硬化的發病呈正相關[7]，大量的LDL-cho沉積可導致其向血管內膜下遷移并聚集，促進其進行氧化修飾，進一步損傷血管內皮，促使泡沫細胞增多及動脈斑塊的形成。與LDL-cho相反的是，HDL-cho可以將膽固醇攜帶到肝臟代謝，與動脈粥樣硬化發病呈現負相關。本次研究也證實散結通脈方具有顯著的降血脂作用。動脈粥樣硬化（AS）是一種多因性疾病，血管內皮損傷后多種炎性細胞聚集、吸附于動脈內膜，并合成釋放多種炎性因子如hs-CRP、腫瘤壞死因子、IL-6、IL-1等，進而刺激巨噬細胞吞噬氧化LDL-C，成為泡沫細胞，沉積為脂質條紋，由此可見，炎性反應貫穿了AS形成的始終，并在AS的發生發展中發揮了極其重要作用。研究表明，AS病變的早期階段存在凋亡細胞的激活，并引發炎癥，生理狀態下巨噬細胞可吞噬凋亡細胞以調節炎癥反應，但由于巨噬細胞大量吞噬氧化LDL-C，導致吞噬凋亡細胞能力降低。血管內膜炎癥反應加強可加劇AS斑塊膠原降解，纖維帽變薄，形成了易損斑塊。hs-CRP作為心腦血管疾病的敏感指標，可以作為心血管疾病的獨立預測因子，可以預測心血管疾病發生的風險，預測斑塊穩定性和未來心血管意外事件，hs-CRP水平高低可反映斑塊的易損程度，如能降低hs-CRP的表達，可起到延緩動脈粥樣硬化及穩定粥樣斑塊的作用[8-10]。IL-6是動脈粥樣硬化進程中的炎癥標志物，同時也是心血管疾病的獨立危險因素。IL-6能夠將急性炎性反應放大，促進慢性炎癥反應的產生，是炎癥反應的一個中樞性調節因子[11-13]。

Ca2+作為細胞內重要的第二信使，在介導細胞內信號轉導及細胞的生理機能中發揮重要作用，而Ca2+失穩態參與了心血管疾病、糖尿病、阿爾茲海默病等疾病的發生發展。以往的研究也顯示，金屬離子對動脈斑塊的形成起促進作用，且動脈斑塊中Ca2+濃度顯著高于正常組織。生理條件下，鈣池操縱性鈣通道（store-operates cation channels，SOCC）是非興奮細胞介導外鈣內流的重要離子通道，對細胞內鈣的穩態起到重要作用，直接參與調節血管平滑肌細胞的增殖、遷移、收縮等活動。鈣釋放激活鈣通道調節分子1（Orai1）和基質交聯分子 1（STIM1）是構成鈣池操縱性鈣通道（SOCC）的主要構成因子[14]。有研究顯示，血小板活化在冠狀動脈易損斑塊的形成及發展中發揮重要作用，而SOCC則是激活血小板的關鍵，通過對冠心病患者冠狀動脈易損斑塊與SOCC及瞬時受體電位通道1（TRPC1）之間關系的探討，發現易損斑塊組血小板STIM1、Orai1高表達[15-16]。尿緊張素Ⅱ是促進血管平滑肌細胞增殖的血管活性肽，可通過激活SOCC增加VSMCs外鈣內流，從而促進VSMCs增殖，且此作用可被SOCC阻斷劑或基因沉默其結構蛋白STIM1、Orai1逆轉[17]。SOCC介導的鈣內流在動脈粥樣硬化發生發展中具有重要作用，STIM1、Orai1是SOCC的主要組成分子，他們之間的相互作用促成了動脈粥樣硬化斑塊的發生發展，由此可知，SOCC是治療動脈粥樣硬化的重要靶點[18-21]。本研究結果表明，散結通脈方可明顯降低STIM1、Orai1水平，可以通過下調鈣離子信號蛋白的表達抑制血管平滑肌細胞增殖遷移，并通過發揮調脂、抗炎等多種效應，對動脈粥樣硬化發生發展過程中多因素多環節起到調節作用，進而延緩甚或逆轉不穩定斑塊的病理進程。