抵擋湯早期干預調節MMPs/TIMPs平衡對2型糖尿病大鼠大血管纖維化的影響

任秋月，劉 鵬，姚蓉飛，常 柏*

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院,天津 300134）

糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發癥之一，主要以動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）為病理基礎，在前期工作中發現，糖尿病大血管病變病理學改變以纖維化為重[1]。纖維化是由膠原的形成和沉著過量及細胞外基質(ECM)改變導致組織或器官的纖維組織增生。而基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissuse inhibitor of metalloproteinase,TIMPs）及二者間的平衡在細胞外基質（ECM）代謝中起著決定性作用[2]。抵擋湯方出于《傷寒論》，原方由大黃、水蛭、桃仁、虻蟲組成，我們在臨床應用中以抵擋湯（水蛭3 g，虻蟲1.5 g，桃仁5 g，熟大黃10 g）干預后，明顯改善2型糖尿病患者血管內皮舒張功能，修復內皮功能損傷，延緩2型糖尿病大血管病變的發生發展[3]。本研究擬通過以抵擋湯在糖尿病早期、糖尿病期、糖尿病晚期不同時間點干預，探討抵擋湯對2型糖尿病大血管病變細胞外基質合成、分解平衡的調節作用，進而改善大血管纖維化的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，普通級，4周齡，體質量（200.5±5.2）g，天津實驗動物中心提供（合格證號：SCXK津 2014-0001）。自由進食進水，適應性飼養1周納入試驗。抵擋湯組成：水蛭3 g，虻蟲1.5 g，桃仁5 g，熟大黃10 g，購于天津中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，按傳統工藝制備水煎劑，減壓濃縮至濃度為1 g/mL，4。C保存備用。氨基胍，美國Sigma公司生產。鹽酸吡格列酮片，日本武田公司，規格每片15 mg，批號：J20090134。鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）；胰島素放免測定試劑盒（天津九鼎醫學生物工程有限公司）；pH值4.2的枸櫞酸鈉緩沖液（天津試驗動物中心實驗室配制）；MMP-1，MMP-2，MMP-8，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 ELISA試劑盒（上?；顦飞锕荆?；高速離心機（德國Eppendorf公司）、酶標儀（450 nm）（MolecularDevices公司）。

1.2 造模與分組 SD大鼠60只，適應性喂養1周后，隨機抽取10只作為正常對照組，給予標準飼料喂養，其余50只為糖尿病模型組給予高脂飼料喂養，8周后，空腹內眥采血測空腹血糖（FBG）和胰島素（Ins）計算胰島素敏感指數ISI=Ln[（FBG）（FINS）]-1，判斷動物出現胰島素抵抗后，隨機選取糖尿病模型組大鼠10只作為抵擋湯早期干預組，按人鼠等效劑量予抵擋湯2 g/（kg·d）灌胃4周。12周后，除正常對照組外，其他大鼠24 h禁食不禁水，尾靜脈注射STZ 30 mg/kg（用前以pH值4.2的0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液配成1%終濃度）。正常對照組僅注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。3 d后尾靜脈采血測血糖，隨機血糖＞16.7 mmol/L視為2型糖尿病大鼠造模成功。造模成功后（除正常對照組、抵擋湯早期干預組外）按血糖、體質量隨機分為糖尿病組、抵擋湯中期干預組、抵擋湯晚期干預組、氨基胍組、吡格列酮組。

1.3 干預及標本采集 所有干預組均以體表面積折合成等效劑量給藥。抵擋湯早期、中期、晚期干預組分別于成模前4周、成模時、成模后4周予抵擋湯2 g/（kg·d）灌胃；吡格列酮組與氨基胍組成模時分別給予1.35 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）灌胃。糖尿病組及正常對照組均予等劑量無菌飲用水每日灌胃1次。于24周時結束飼養并戊巴比妥麻醉下，股動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取上層血清-80 ℃冰箱中保存，用于ELISA法檢測。

1.4 酶聯免疫吸附法（ELISA）血清解凍后用ELISA試劑盒分別檢測大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白水平，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，根據各樣本在酶標儀450 nm處的OD值以及標準曲線，計算樣品濃度。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示。2組樣本均數間比較采用獨立樣本t檢驗，組間差異比較采用單因素方差分析，組間方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnet’s T3法。

2 結果

2.1 2型糖尿病大鼠動物模型制備 8周后，與正常對照組相比，糖尿病模型組空腹血糖升高（P＜0.05），胰島素水平升高（P＜0.05），胰島素敏感指數降低（P＜0.05），表明大鼠出現胰島素抵抗，高脂喂養糖尿病前期模型大鼠造模成功。見表1。

2.2 不同干預對大鼠血糖的影響 抵擋湯干預各組之間血糖無顯著差異，表明抵擋湯無明顯降糖作用；與糖尿病組相比，吡格列酮組血糖明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 抵擋湯對大鼠血清基質金屬蛋白酶蛋白表達的影響 與正常對照組相比，糖尿病組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與糖尿病組相比，抵擋湯早、中期干預組、氨基胍組及吡格列酮組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），且抵擋湯早期干預組MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白水平高于其他藥物干預組（P＜0.05）。見表3。

表1 實驗第8周大鼠空腹血糖、胰島素水平及胰島素敏感指數比較（）

表1 實驗第8周大鼠空腹血糖、胰島素水平及胰島素敏感指數比較（）

注：與正常對照組比較，# P ＜0.05

表2 各組血糖變化情況（，n =8）

表2 各組血糖變化情況（，n =8）

注：與正常對照組比較，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05

表3 各組大鼠血清基質金屬蛋白酶（MMPs）蛋白表達（，n =8） pg/mL

表3 各組大鼠血清基質金屬蛋白酶（MMPs）蛋白表達（，n =8） pg/mL

注：與正常對照組比較，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05；與抵擋湯早期干預組比較，▲P ＜0.05

2.4 抵擋湯對大鼠血清基質金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）蛋白表達的影響 與正常對照組相比，糖尿病組大鼠血清中TIMP-1、TIMP-2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與糖尿病組相比，抵擋湯早、中期干預組、氨基胍組及吡格列酮組大鼠血清中TIMP-1、TIMP-2蛋白表達均明顯下降（P＜0.05），且抵擋湯早期干預組TIMP-1、TIMP-2蛋白表達顯著低于抵擋湯中、晚期干預組（P＜0.05）。見表4 。

2.5 抵擋湯對大鼠血清MMPs/TIMPs比例平衡的影響 與正常對照組相比，糖尿病組大鼠血清中MMPs/TIMPs比例有明顯下降（P＜0.05）；與糖尿病組相比，抵擋湯早、中期干預組、氨基胍組MMP-9/TIMP-1比值升高（P＜0.05），抵擋湯早、中、晚期干預組MMP-2/TIMP-2比值升高（P＜0.05）；且抵擋湯早期干預組MMPs/TIMPs顯著高于抵擋湯中、晚期干預組（P＜0.05）。見表5。

表4 各組大鼠血清基質金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）蛋白表達（，n =8） pg/mL

表4 各組大鼠血清基質金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）蛋白表達（，n =8） pg/mL

注：與正常對照組比，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05；與抵擋湯早期干預組比較，▲P ＜0.05

表5 各組大鼠血清MMP-9/TIMP-1，MMP-2/TIMP-2比值（，n =8）

表5 各組大鼠血清MMP-9/TIMP-1，MMP-2/TIMP-2比值（，n =8）

注：與正常對照組比較，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05；與抵擋湯早期干預組比較，▲P ＜0.05

3 討論

糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發癥之一，糖尿病患者中，大血管病變的患病風險是非糖尿病患者的2～4倍[4]。研究表明，大血管病變在糖尿病前期階段已經開始出現[5-6]。我們前期研究中發現，糖尿病足患者高位截肢的脛后動脈轉化生長因子β（TGF-β）表達明顯增加，管腔出現中、重度狹窄，管壁增厚硬化，內膜以纖維性增厚為主，纖維成分所占比例大，中膜鈣鹽散在或者大范圍沉積[1]，提示糖尿病大血管病變病理學改變以纖維化為重。

血管纖維化表現在過量的ECM沉積，導致血管腔的狹窄及動脈壁的增厚。在血管，ECM可形成內膜表面的黏附保護層、內膜下層、基底膜、內彈力膜、中膜和外膜結締組織等等，是血管壁的主要成分，包括膠原、蛋白聚糖、纖維連接蛋白、黏連蛋白、彈力蛋白等，在細胞生長、增殖、遷移、分化、損傷修復、血管重構中發揮重要調節作用。MMPs是一類含Zn2+的內源性蛋白水解酶，可降解ECM中除多糖以外的所有成分[7]。至今發現的20多種MMPs可分為6類，其中明膠酶類包括MMP-2、MMP-9，主要降解變性膠原蛋白、明膠、Ⅳ型基底膜膠原。間質膠原酶類包括MMP-1、MMP-8，作用較廣泛，可降解各類膠原和大部分蛋白多糖核心[8]。研究表明，MMPs參與動脈粥樣硬化、結締組織疾病、腫瘤、冠心病、臟器纖維化的發生發展過程[9-10]。TIMPs為MMPs特異性組織抑制因子，能特異性與MMPs催化中心的Zn2+結合，封閉其催化活性，通過與MMPs共價結合，阻斷MMPs的活性作用，形成一個以ECM為中心的復雜的、動態的、可調節的合成、代謝微環境。在正常狀態下TIMPs與MMPs之間維持動態平衡，有助于保持細胞外基質的代謝平衡與成分穩定[11-12]，一旦平衡被打破，則造成血管EMC的代謝紊亂，MMPs/TIMPs已成為肺[13]、肝[14]、心[15]、腎[16]等器官纖維化的研究和逆轉靶點。其中，TIMP-1能特異性抑制MMP-9的活性，而TIMP-2則特異性抑制MMP-2的活性。

Sarper M等[17]研究顯示，在胰腺纖維化的發展過程中，MMPs/TIMPs比值下調，促進ECM分泌增加。在肝纖維化發展過程中，TIMP-2增強，抑制MMP-2的活性，導致Ⅳ型膠原含量增多，減少ECM降解。本研究結果顯示，2型糖尿病大血管病變大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白表達均顯著減少，TIMP-1、TIMP-2表達增加，MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2比值下降，與既往研究一致。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物（TZDs），是目前臨床常用的一類降糖藥物，已有研究表明吡格列酮不僅能改善胰島素抵抗，還可能通過降低血管炎癥反應、改善血管內皮功能的途徑來延緩糖尿病患者大血管損傷的進展。氨基胍是一種誘導性一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑，可通過抑制iNOS產生進而能夠調節MMPs的表達，本研究采用不同作用機制保護血管損傷的藥物作為陽性對照藥，結果表明2組大鼠血清MMPs表達量較糖尿病組明顯升高且TIMPs表達下降，提示二者均可延緩大血管纖維化進展，而抵擋湯早期干預組與此2組結果無差異。

2型糖尿病大血管病變屬于中醫“消渴”變證，氣陰兩虛，陰損及陽，漸致痰濁瘀毒等病理產物積聚，絡瘀脈損，瘀血貫穿于2型糖尿病大血管病變的始終。對于纖維化，中醫學認為，瘀血既是纖維化的病理產物，又是病情加重的因素[18-19]，瘀血貫穿于器官纖維化的整個病程[20]。抵擋湯以善飲血之水蛭為君，善吮血之虻蟲為臣，善破諸經瘀血之桃仁為佐，善行君令之將軍大黃為使，破血逐瘀，蕩滌邪熱，推陳出新。以抵擋湯論治，把握了脈絡瘀阻的主要病機。本研究以抵擋湯分別在糖尿病早、中、晚期進行干預，結果顯示早期干預可通過上調MMPs、下調TIMPs，扭轉MMPs/TIMPs比例失衡介導的ECM的合成分解紊亂，改善2型糖尿病大血管病變纖維化。為臨床治療糖尿病大血管病變提供思路，并為中醫“治未病”提供理論依據。