miR-6523a對延邊黃牛垂體細胞中生長激素分泌的影響

婁安鋼 季久秀 相思宇 金太花 張睿 崔長艷 關立增

摘要：為研究血液外胞體中miRNA對延邊黃牛垂體細胞中生長激素（GH）分泌的影響，本研究選擇在延邊黃牛和韓延牛血液外胞體中顯著差異表達的miR-6523a，利用實時定量PCR（qPCR）和Western Blot技術，研究了miR-6523a對延邊黃牛垂體細胞中GH分泌水平的影響及miR-6523a與靶基因間的調控機制。生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因系統結果顯示，miR-6523a靶向了SSTR5的3′非翻譯區（UTR）;qPCR和Western Blot檢測結果顯示，與對照組相比，添加miR-6523a-mi能極顯著提高延邊黃牛垂體細胞中GH mRNA和蛋白的表達（P<0.01），而添加miR-6523a-in，GH mRNA和蛋白的表達有所降低，但和對照組相比差異不顯著（P>0.05）;與對照組相比，添加 miR-6523a-mi 能極顯著抑制SSTR5 mRNA和蛋白的表達（P<0.01），而添加miR-6523a-in，SSTR5 mRNA和蛋白的表達均有所提高，但和對照組相比差異不顯著（P>0.05）。本研究表明，miR-6523a可通過調節SSTR5基因的表達而調控垂體細胞中GH的分泌，本研究結果將為研究外胞體miRNA調控動物生長發育機制提供理論依據。

關鍵詞：miR-6523a;延邊黃牛;垂體細胞;GH;SSTR5

中圖分類號： S823.8+11文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0202-06

收稿日期：2019-08-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：31660614）。

作者簡介：婁安鋼（1980—），男，吉林延吉人，博士，講師，主要從事動物的遺傳與育種研究。E-mail：1163986278@qq.com。

通信作者：關立增，博士，副教授，碩士生導師，主要從事動物基因的表達與調控研究。E-mail：guanlizeng@163.com。延邊黃牛具有生長速度慢、生長周期長和出欄率低等缺點，導致飼料資源浪費和飼養成本提高，這嚴重制約了延邊黃牛養殖業的健康發展[1-3]。因此，如何提高純種延邊黃牛的生長速度、縮短其養殖周期是加快延邊黃牛養殖產業快速發展的關鍵。研究表明，外胞體（exosome）中miRNA對動物的生長發育發揮著重要的調控作用。如Melnik等研究發現，牛乳exosome中的miRNA-21可以促進犢牛的生長[4]。陳婷用來源于豬exosome的 miR-PC-86、miR-PC-263處理C2C12細胞，結果顯示二者可調控C2C12細胞上胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）的表達，從而對豬肌細胞生長發揮調控的作用[5]。由此可見，exosome中的一些miRNA可能與動物生長發育存在密切的關系，那么exosome中miRNA是否具有調控延邊黃牛生長速度、提高生長效率的作用有待進一步研究。

在動物生長發育過程中，生長軸起著關鍵的作用[6-7]。而在生長軸中腺垂體分泌的生長激素（GH）是最重要的成分之一[8-9]。因此，為更全面地了解exosome中miRNA在調節延邊黃牛生長過程中的作用，本研究在前期工作中選擇以延邊黃牛和在長發育速度、初生質量及各年齡段體尺體質量等均極顯著高于延邊黃牛的韓延牛作為研究對象，利用生物信息學技術分析了延邊黃牛及韓延牛血液exosome中顯著影響GH分泌的差異表達miRNA，并篩選出顯著差異表達的miR-6523a。但關于 miR-6523a 對延邊黃牛垂體中GH的分泌的影響機制還不清楚，因此本研究旨在在體外垂體細胞水平上探究miR-6523a對延邊黃牛垂體GH分泌的調控機制，進而為進一步研究外胞體miRNA調控動物生長發育機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要儀器Bio-Rad 650型酶標儀（美國Bio-Rad公司）;倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）;熒光定量PCR儀（美國ABI公司）;2406-2型CO2培養箱（美國Thermo公司）;凝膠成像系統（英國Ultro-Violet Products公司）。

1.1.2主要試劑XhoⅠ、XbaⅠ，購自寶生物工程（大連）有限公司;DMEM/F12培養液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ及青霉素、鏈霉素、LipofectamineTM 2000，均購自GIBCO公司;GH抗體、SSTR5抗體，均購自Abcam公司;β-actin抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司;總蛋白提取試劑盒，購自北京佳蘭生物科技有限公司;miR-6523a的模擬物（mimics）（miR-6523a-mi）、抑制劑（inhibitor）（miR-6523a-in）、陰性對照（NC）、抑制劑陽性對照（iNC），均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成;雙熒光報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2試驗方法

1.2.1miR-6523a的靶基因預測利用targetscan和RNAhybrid分析軟件對miR-6523a與GH合成分泌相關的基因（GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5等）的靶關系進行預測。

1.2.2延邊黃牛垂體細胞原代培養垂體細胞原代培養方法參考文獻[10]。在無菌條件下分離3頭延邊黃牛的垂體組織，分別剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，用pH值為7.0的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3遍后，接種于75 mL培養瓶中，加入DMEM/F12培養液，放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞從組織塊中爬壁生長至80%時，采用0.25%膠原酶消化，并通過差速貼壁法分離細胞，獲得垂體原代培養細胞。

1.2.3miR-6523a對延邊黃牛腺垂體細胞中GH mRNA轉錄水平的影響按“1.2.2”節中所述方法對延邊黃牛的垂體組織細胞進行原代培養后，按2.0×106個細胞/孔的密度將垂體細胞接種至6孔培養板中，待細胞匯合度為60%～70%時進行轉染試驗。轉染前采用2 mL PBS漂洗細胞1次，并加入 0.7 mL DMEM/F12培養液和100 μL 1 μmol/L 生長抑素（SS），之后分別將miR-6523a的mimics、inhibitor、NC對照、iNC對照分別稀釋到100 μL DMEM/F12培養液中。然后將10 μL轉染試劑LipofectamineTM 2000稀釋至100 μL DMEM/F12培養液中，之后將上述稀釋液分別按1 ∶1體積比混合，室溫孵育 10 min 后，將200 μL混合物加入到上述預處理的細胞孔中，使mimics、inhibitor、NC對照、iNC對照最終濃度為200 pmol/L，每組設3次重復。為了避免轉染毒性，6 h后吸棄含轉染試劑的培養基，同時置換新的培養基繼續培養48 h，收集細胞，提取總mRNA。采用熒光定量PCR（qPCR）法檢測GH mRNA的轉錄情況，具體步驟參考文獻[10]中的方法進行。

1.2.4miR-6523a對延邊黃牛腺垂體細胞中GH蛋白表達的影響根據總蛋白提取試劑盒的步驟對“1.2.3”節中獲得的細胞進行總蛋白提取，并進行GH蛋白Western Blot檢測具體步驟如下：按常規方法配制10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離膠和5% PAGE濃縮膠并放入垂直電泳槽中，待其凝固后，拔出木梳并向梳孔中加入1×甘氨酸緩沖液，然后加入50 μg制備的總蛋白樣品進行電泳。電泳結束后，將上述蛋白膠進行轉膜，所用膜為聚偏氟乙烯（PVDF），轉膜條件為110 V、60～70 min，轉膜結束后取出PVDF膜，進行麗春紅染色，檢驗轉膜效果;之后采用1×TBST溶液洗滌膜數次，去除麗春紅染色液，再用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉2 h;之后將封閉的PVDF膜放入5 mL離心管中，加入 2 mL GH蛋白一抗，4 ℃條件下孵育過夜（12 h）。孵育結束后，采用1×TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10 min。將洗滌后的PVDF膜放入新的 5 mL 離心管中，加入2 mL 1 ∶5 000稀釋的GH蛋白二抗，室溫孵育2 h。孵育結束后，用1×TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5 min。然后將PVDF膜置于發光液中顯色1 min后，在凝膠成像系統中曝光，并與β-actin內參基因的表達進行比較，計算GH蛋白的相對表達量。

1.2.5miR-6523a與SSTR5靶關系驗證將能與miR-6523a種子序列匹配的SSTR5 3′非翻譯區（UTR）區域的上、下游30 bp之內的序列進行人工合成，同時將與miR-6523a種子序列匹配區域的5個堿基進行人工突變作為對照，逐步確定miR-6523a真正結合位點。然后用限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ酶切上述人工合成的片段及人工突變片段，將酶切產物分別與熒光素酶基因報告載體（pirGLO載體）連接，構建重組pirGLO-SSTR5-3′UTR表達載體和突變載體，獲取無內毒素質粒。之后將miR-6523a的mimic、NC與構建好的pirGLO-SSTR5-3′UTR正常或缺失載體分別稀釋為200 pmol/L，然后在轉染試劑LipofectamineTM 2000的作用下共轉染中國倉鼠卵巢癌細胞（CHO）細胞，具體轉染過程參考“1.2.3”節中的方法。48 h后收集細胞、裂解，按熒光素酶檢測試劑盒步驟檢測熒光素酶的活性，以驗證miR-6523a與SSTR5之間的靶關系。

1.2.6miR-6523a對延邊黃牛腺垂體細胞中SSTR5的mRNA轉錄水平和蛋白表達的影響SSTR5 mRNA轉錄水平的qPCR檢測和蛋白的Western Blot檢測均參考“1.2.3”和“1.2.4”節中的方法進行。

1.2.7數據分析采用SPSS 13.0軟件進行數據分析，結果以 x±s的形式表示。*、**分別表示與NC或iNC對照組比較差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）。

2結果與分析

2.1miR-6523a與調控GH分泌相關基因靶關系預測

本試驗使用targetscan和RNAhybrid分析軟件對miR-6523a與GH合成分泌相關的基因（GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1、SSTR5等）靶關系進行分析。結果顯示，miR-6523a的靶基因為SSTR5。

2.2miR-6523a對GH基因mRNA轉錄水平的影響

為分析miR-6523a對延邊黃牛垂體GH基因表達的影響，本研究首先用miR-6523a mimics及inhibitor轉染原代培養的延邊黃牛垂體細胞，然后對GH基因mRNA表達進行檢測。由圖1可知，與對照組相比，添加miR-6523a-mi能夠極顯著提高GH mRNA的轉錄水平（P<0.01），而添加miR-6523a-in能降低GH mRNA的轉錄水平，但與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.3miR-6523a對GH蛋白表達的影響

為了進一步驗證miR-6523a對延邊黃牛垂體GH蛋白表達的影響，本研究在GH mRNA轉錄檢測結果基礎上進一步對GH蛋白的表達水平進行Western Blot檢測。由圖2可知，與對照組相比，添加miR-6523a-mi 能夠極顯著提高GH蛋白表達水平

（P<0.01），而添加miR-6523a-in能降低GH蛋白的表水平，但與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.4miR-6523a與SSTR5靶關系驗證

為驗證miR-6523a與SSTR5之間是否存在靶位關系，本研究將pirGLO-SSTR5-3′UTR正常或突變載體分別與miR-6523a/NC共轉染CHO細胞，從而通過熒光素酶活性的變化反映miR-6523a與SSTR5是否存在靶關系。由圖3可知，miR-6523a能顯著降低pirGLO-SSTR5-3′UTR正常質粒熒光素酶的活性，而對pirGLO-SSTR5-3′UTR突變體無抑制效果。由此可知，miR-6523a能結合并作用于SSTR5的3′UTR區域，miR-6523a與SSTR5之間存在靶位關系。

2.5miR-6523a對SSTR5基因mRNA表達的影響

為驗證miR-6523a對SSTR5基因的調控功能，本試驗首先用miR-6523a mimics及inhibitor轉染原代培養的延邊黃牛垂體細胞，然后對SSTR5基因mRNA轉錄水平進行qPCR檢測。由圖4可知，與對照組相比，添加miR-6523a-mi能夠極顯著降低SSTR5 mRNA的轉錄水平（P<0.01），而添加miR-6523a-in能提高SSTR5 mRNA的轉錄水平，但與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.6miR-6523a對SSTR5蛋白表達的影響

為了進一步驗證miR-6523a對延邊黃牛垂體SSTR5蛋白表達的影響，本研究在SSTR5 mRNA轉錄檢測結果基礎上進一步對SSTR5蛋白表達的變化進行Western Blot檢測。由圖5可知，與對照組相比，添加miR-6523a-mi能夠極顯著降低SSTR5

蛋白的表達水平（P<0.01），而添加miR-6523a-in能提高SSTR5蛋白的表達水平，但與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

3討論與結論

外胞體中的miRNA可通過血液等體液的運輸，被運輸到動物機體的各個組織細胞并可通過細胞膜進入細胞內，從而在生長調控、細胞間通訊交流、免疫調節、信號傳遞等過程中發揮著重要的作用[11-12]。研究表明，exosome中的miRNA具有調控動物生長的功能[4-5]。此外筆者所在課題組在對生長性能有顯著差異的延邊黃牛和韓延牛血液exosome中的miRNA進行差異分析時，也發現在2個品種牛exosome中的miRNA存在著顯著性差異，因此筆者所在課題組選擇以在延邊黃牛和韓延牛血液exosome中有顯著差異的miRNA去研究其對延邊黃牛的生長性能的調控具有一定意義。

筆者所在課題組的前期研究工作證明，外胞體中的miR-6523a在延邊黃牛和韓延牛之間呈現顯著性差異表達，因此推理miR-6523a可能參與了生長調控過程，可能是造成延邊黃牛和韓延牛生長性能差異的主要因素之一，而在動物生長發育過程中，生長軸起著關鍵的作用，而在生長軸中腺垂體分泌的GH是最重要的成員之一[13]。GH可通過與生長激素結合蛋白（GHBP）結合而運輸，與靶器官上生長激素受體（GHR）結合，促使胰島素樣生長因素（IGFs）的產生并進入血液循環，IGFs再通過與胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）結合轉運到全身組織細胞，刺激骨、軟骨細胞的生長和分化，調節蛋白質、糖及脂肪的代謝等[14]。因此，本研究對 miR-6523a與GH分泌之間的關系進行了探索。為初步確定miR-6523a是否與GH的分泌調控有關，本研究首先通過生物學分析軟件對miR-6523a與GH分泌相關的調控基因進行了靶關系分析。研究資料表明，與GH合成分泌相關的基因主要有GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1、SSTR5等[15]。鑒于此，筆者所在課題組利用targetscan和RNAhybrid分析軟件分別對miR-6523a與GHRHR、SSTR2、LEF1、POU1F1和SSTR5的靶關系進行分析。分析結果表明，miR-6523a的種子序列只與SSTR5基因存在靶關系。研究表明，SSTR5與生長抑素（SS）結合后通過與G蛋白偶聯進而調控GH的合成[16]。而通過進一步的熒光素酶報道基因驗證結果顯示，miR-6523a能顯著降低pirGLO-SSTR5-3′UTR正常質粒熒光素酶的活性，而對缺失載體的熒光素酶活性無影響，上述結果不僅說明miR-6523a與SSTR5之間存在著靶位關系，同時可初步推測 miR-6523a 是通過調控SSTR5的表達而影響GH分泌的。

為進一步驗證miR-6523a是否參與了垂體細胞GH的分泌調節，本研究利用miR-6523a mimics和inhibitor對延邊黃牛垂體細胞進行了轉染試驗，并利用qPCR和Western Blot技術對延邊黃牛垂體細胞中GH mRNA和蛋白表達水平進行了檢測。qPCR和Western Blot檢測結果顯示，通過轉染 miR-6523a mimics能極顯著增加GH mRNA和蛋白的表達，而轉染miR-6523a inhibitor能降低相應GH mRNA和蛋白的表達，該結果說明miR-6523a參與了調控垂體細胞中GH的分泌過程。

雖然，本研究通過生物信息學分析和報告基因系統驗證了miR-6523a與SSTR5的靶關系，但在垂體細胞水平上miR-6523a對SSTR5基因表達具體影響結果仍然未知。因此，筆者所在課題組對延邊黃牛垂體細胞進行miR-6523a mimics和inhibitor轉染試驗，并利用qPCR和Western Blot檢測SSTR5基因的mRNA和蛋白的表達變化。結果顯示，通過轉染miR-6523a-mi能極顯著降低SSTR5 mRNA和蛋白的表達，而轉染miR-6523a-in能提高SSTR5 mRNA和蛋白的表達。因此，此結果進一步證明了miR-6523a與SSTR5之間存在靶關系，并說明 miR-6523a是通過與SSTR5作用而間接正調控GH分泌的。

總之，本研究結果證明，miR-6523a可以通過靶向SSTR5進而調節GH的表達。本研究成果將為進一步研究外胞體miRNA調控動物生長發育機制提供理論依據，也將為延邊黃牛生長發育調控提供新的作用靶標。

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