蔓花生AP2基因家族的生物信息學(xué)分析

王玲 劉曉偉 江納 付春

摘要：AP2作為一類(lèi)植物轉(zhuǎn)錄因子，在花的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)器官的形成過(guò)程中都起著非常重要的作用。旨在對(duì)蔓花生（Arachis duranensis）AP2蛋白的理化性質(zhì)及分子進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，蔓花生AP2基因家族成員編碼蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均在細(xì)胞核中，有11個(gè)成員的理論等電點(diǎn)小于7，推測(cè)該家族蛋白多為酸性蛋白，有8個(gè)成員存在2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域;該家族成員均無(wú)信號(hào)肽;除了Aradu.SE6Q0與Aradu.42K79成員中存在跨膜現(xiàn)象外，其他成員鮮少出現(xiàn)跨膜現(xiàn)象。親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的親疏水性系數(shù)均小于0，推測(cè)其為親水蛋白;磷酸化位點(diǎn)主要集中在絲氨酸上;其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。研究還得出，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的主要保守基序是Motif1、Motif2和Motif4;Motif3、Motif4都含有YRG結(jié)構(gòu)域，Motif5含有RAYD結(jié)構(gòu)域;構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也有力地說(shuō)明了AP2基因家族的進(jìn)化程度。

關(guān)鍵詞：蔓花生;AP2基因;基因家族;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： S541+.901? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0065-13

蔓花生（Arachis duranensis），別稱(chēng)遍地黃金，是豆科蝶形花亞科蔓花生屬的多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于亞洲熱帶及南美洲地區(qū)，其根系發(fā)達(dá)，抗逆性強(qiáng)，病蟲(chóng)害少，是動(dòng)物的良好牧草[1-6]。蔓花生有一定的耐熱耐旱性、抗寒性、耐陰性、耐貧瘠性[2-3，7-13]，對(duì)有害氣體有較強(qiáng)的抗性[14-15]。APETALA2（AP2）是一類(lèi)植物轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)首次被發(fā)現(xiàn)于擬南芥中，并證實(shí)在花的發(fā)育過(guò)程中和營(yíng)養(yǎng)器官中均有表達(dá)[16-20]。該類(lèi)因子由60～70個(gè)氨基酸殘基組成，并參與DNA的結(jié)合過(guò)程[18，21-22]。AP2基因家族是AP[STBX]2[STBZ]/ERF超級(jí)基因家族下的1個(gè)分支，其家族蛋白包含2個(gè)重復(fù)的AP2結(jié)構(gòu)域，即AP2-R1和AP2-R2，根據(jù)2個(gè)結(jié)構(gòu)域是否含有插入序列，將AP2基因家族分為ANT組、euAP2組，此外，AP2基因家族還含有較長(zhǎng)的識(shí)別序列GCAC（A/G）N（A/T）TCCC（A/G）ANG（C/T）元件[23-28]。AP[STBX]2/ERF超級(jí)基因家族中除AP2[STBZ]家族外，還包括ERF家族和RAV家族，ERF家族編碼蛋白含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，RAV家族編碼蛋白含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，其中B3結(jié)構(gòu)域在其他植物的特異轉(zhuǎn)錄因子中是1個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[21]。AP[STBX]2[STBZ]/ERF亞家族成員通過(guò)與CC、CRT/DRE、JERE或VWRE等作用元件相互作用而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)[29-32]。AP2參與花發(fā)育、小穗分生組織的形成、葉表皮細(xì)胞識(shí)別和胚胎發(fā)育等過(guò)程的調(diào)控[33]以及花器官的識(shí)別，如花瓣、萼片[34-38]。在AP[STBX]2[STBZ]家族編碼蛋白中，擬南芥蛋白AP213（AP2）、AP2-14（TOE1）、AP2-8（AIL6）、AP2-12（AIL7）含有EAR-like基序[17]。AP2的CAP2在鷹嘴豆（Cicer arietinum Linn.）中具有抗鹽、抗干旱脅迫的功能[39]，EgAP2-1在油棕（Elaeis guineensis Jacq.）中調(diào)控合子和體細(xì)胞胚的發(fā)育[40]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化在擬南芥、水稻和大豆中是相對(duì)保守的[41]，許多亞家族和亞類(lèi)存在于這3個(gè)物種中，這說(shuō)明絕大多數(shù)AP2/ERF亞家族成員存在于物種分化之前[18]。AP[STBX]2[STBZ]轉(zhuǎn)錄基因在花生種子發(fā)育的4個(gè)時(shí)期的表達(dá)存在差異[33]，其通過(guò)影響胚、胚乳和種皮的發(fā)育來(lái)控制種子的大小，同時(shí)通過(guò)對(duì)糖代謝的影響來(lái)影響種子的質(zhì)量[18，39，42]。目前尚未見(jiàn)關(guān)于蔓花生AP2基因家族理化特性及其進(jìn)化關(guān)系的報(bào)道，因此，本研究以蔓花生AP2蛋白序列為材料，利用生物信息學(xué)工具對(duì)蔓花生AP2基因家族的理化特性、保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)研究，以期為進(jìn)一步研究和揭示AP2基因家族在蔓花生生長(zhǎng)發(fā)育、基因調(diào)控中的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)[43]（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）中下載蔓花生、野花生、花生3個(gè)落花生屬和擬南芥的AP2蛋白序列，以及二穗短柄草（Brachypodium distachyon）AP2家族成員Bradi2g37800.13.p、鷹嘴豆AP2家族成員XP 004506004.1、黃花蒿（Artemisia annua）AP2家族成員Aan013559、木豆（Cajanus cajan）AP2家族成員C.cajan 21449、大豆（Glycine max）AP2家族成員Glyma.12G073300.1.p、綠豆（Vigna radiata）AP2家族成員Vradi03g03260.1、蕓豆（Phaseolus vulgaris）AP2家族成員Phvul.011G071100.1、向日葵（Helianthus annuus）AP2家族成員Han007343、芝麻（Sesamum indicum）AP2家族成員XP 011089852、蓖麻（Ricinus communis）AP2家族成員28752.m000339、玉米（Zea mays）AP2家族成員GRMZM2G700665 P03、印度水稻（Oryza sativa ssp. indica）AP2家族成員BGIOSGA018911-PA、小麥（Triticum urartu）AP2家族成員TRIUR3 14819-P1的蛋白序列。

1.2 方法

1.2.1 蔓花生AP2基因家族理化性質(zhì)的分析及亞細(xì)胞定位 利用在線程序PrtoParam[44-47]（https：//web.expasy.org/protparam/）統(tǒng)計(jì)蔓花生AP2基因家族的編碼氨基酸數(shù)量、理論等電點(diǎn)、分子量、帶正電荷氨基酸殘基數(shù)、帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)和脂肪族氨基酸指數(shù)及總平均親疏水性等理化性質(zhì)信息，并在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中以擬南芥基因序列為探針，進(jìn)行BLAST對(duì)比。利用在線軟件CELLOv2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）[48]對(duì)17條蔓花生的AP2蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.2 氨基酸保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析 利用NCBI Consered Domains[49]（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白進(jìn)行氨基酸保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，對(duì)該家族各個(gè)成員的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量和位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 氨基酸信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析 使用SignalP 3.0 Server[44，46]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預(yù)測(cè)蔓花生AP2基因家族的17個(gè)成員的信號(hào)肽位置;在TMHMM Severv.2.0[44，46-47，49]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線程序中輸入AP2蛋白序列，分析該蛋白是否存在跨膜現(xiàn)象以及是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 氨基酸親疏水性的預(yù)測(cè)分析 利用在線工具Protscale[44]（https：//web.expasy.org/protscale/）對(duì)蔓花生AP2蛋白進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)分析，對(duì)其各個(gè)成員的最大親疏水性所在位點(diǎn)和分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析 使用在線工具NetPhos 3.1 Serve[44，47]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)AP2蛋白序列的潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，找出各個(gè)成員最可能的磷酸化位點(diǎn)及其磷酸化評(píng)分值，以及可能的磷酸化位點(diǎn)數(shù)量與占比。

1.2.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析 使用SOPMA[44]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）程序?qū)βㄉ鶤P2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，對(duì)該家族各個(gè)成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型在各成員中的占比和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì);借助Phyre2網(wǎng)站[44，46-47，50]（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）對(duì)AP2蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.2.7 蔓花生AP2基因家族的蛋白基序分析 利用MEME在線工具[50-51]對(duì)蔓花生AP2基因家族成員進(jìn)行motif查找，設(shè)置查找的motif數(shù)量為10個(gè)，其余參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 用MEGA軟件[44-46，49-50]分別構(gòu)建蔓花生AP2基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，落花生屬蔓花生（Arachis duranensis）、野花生（Arachis ipaensis）和花生（Arachis hypogaea L.）的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)與蔓花生AP2基因家族、擬南芥AP2基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以及蔓花生AP2家族成員Aradu.387PF、二穗短柄草AP2家族成員Bradi2g37800.13.p、擬南芥AP2家族成員AT2G28550.3、鷹嘴豆AP2家族成員XP 004506004.1、黃花蒿AP2家族成員Aan013559、木豆AP2家族成員C.cajan 21449、大豆AP2家族成員Glyma.12G073300.1.p、綠豆AP2家族成員Vradi03g03260.1、蕓豆AP2家族成員Phvul.011G071100.1、向日葵AP2家族成員Han007343、芝麻AP2家族成員XP 011089852、蓖麻AP2家族成員28752.m000339、玉米AP2家族成員GRMZM2G700665 P03、印度水稻AP2家族成員BGIOSGA018911-PA、小麥AP2家族成員TRIUR3_14819-P1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔓花生AP2基因家族編碼蛋白理化性質(zhì)的分析及亞細(xì)胞定位

對(duì)蔓花生AP2基因家族成員編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該家族各蛋白的氨基酸數(shù)量范圍為237～752個(gè)，氨基酸數(shù)量最多的是 Aradu.M2I8I 家族成員（752個(gè)），氨基酸數(shù)量最少的是Aradu.A4KG4家族成員（237個(gè)）;蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)除Aradu.T7UUH成員尚存在爭(zhēng)議外，其余16個(gè)成員的等電點(diǎn)都能分析得出，其中，除 Aradu.387PF、Aradu.RG31X、Aradu.0KI78和Aradu.GIP2Q成員的等電點(diǎn)大于8，Aradu.EJI6Q成員的等電點(diǎn)為7.70外，其余11個(gè)成員的等電點(diǎn)均小于7，說(shuō)明該家族含有大量酸性氨基酸;蛋白不穩(wěn)定指數(shù)分析結(jié)果顯示，除Aradu.M2I8I、Aradu.A4KG4 這2個(gè)成員的不穩(wěn)定指數(shù)小于40外，其余15個(gè)成員的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，說(shuō)明該家族成員多為不穩(wěn)定蛋白;該家族的脂肪族氨基酸指數(shù)分布范圍為4961（Aradu.RG31X）～7258（Aradu.S9CWT），脂肪族氨基酸指數(shù)反映了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[52]，由此說(shuō)明該家族蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性差異較大。由表1中AP2基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果看出，蔓花生AP2蛋白成員均分布在細(xì)胞核中。在蔓花生AP2基因家族成員中，可按對(duì)應(yīng)氨基酸組成分為Ⅲ類(lèi)，其中第Ⅰ類(lèi)以絲氨酸占比最高，第Ⅱ類(lèi)的絲氨酸和天冬酰胺占比一樣，第Ⅲ類(lèi)以天冬酰胺占比最高（圖1）。

2.2 氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，Aradu.387PF、Aradu.42K79、Aradu.EJI6Q、Aradu.G1CDJ、Aradu.M2I8I、Aradu.RG31X、Aradu.GIP2Q、Aradu.SE6Q0這8個(gè)成員均存在2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其余9個(gè)成員均含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。由表2、圖2可以看出，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白成員保守結(jié)構(gòu)域所含氨基酸數(shù)量大于100個(gè)的有7個(gè);所含氨基酸數(shù)量最多的保守結(jié)構(gòu)域在Aradu.M2I8I成員上，共有135個(gè)氨基酸;所含氨基酸數(shù)量最少的保守結(jié)構(gòu)域在Aradu.A4KG4成員上，共有59個(gè)氨基酸。

2.3 氨基酸信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白各氨基酸信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的17個(gè)成員均無(wú)信號(hào)肽，因此推測(cè)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白成員均為非分泌蛋白。

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白成員進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，只有Aradu.SE6Q0和Aradu.42K79這2個(gè)成員存在跨膜現(xiàn)象。成員Aradu.SE6Q0在第236個(gè)氨基酸與第258個(gè)氨基酸之間存在跨膜現(xiàn)象，但并不形成跨膜結(jié)構(gòu)域;成員Aradu.42K79在第349個(gè)氨基酸與第370個(gè)氨基酸之間存在跨膜現(xiàn)象，也并不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)SignalP3.0 Server程序分析可知，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白成員均不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，因此推斷該家族蛋白為非跨膜蛋白。

2.4 氨基酸親疏水性預(yù)測(cè)分析

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的17個(gè)成員進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員Aradu.387PF的第17位精氨酸的親水性最強(qiáng)，為-3.756;成員Aradu.42K79的第262位甘氨酸的疏水性最強(qiáng)，為3.789;總平均親疏水性均小于0，說(shuō)明AP2基因家族編碼蛋白成員均為親水性蛋白。最高親水性值為-1.004，在該基因家族編碼蛋白成員Aradu.A4KG4上;最低親水性值為-0.449，在成員Aradu.T7UUH上（圖3）。

2.5 磷酸化位點(diǎn)分析

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在該家族同一成員之間， 絲氨酸含量總是最高的，其次是蘇氨酸，最低的是酪氨酸;絲氨酸最可能的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最多，且磷酸化評(píng)分值往往在0.997～0.998之間，只有Aradu.A4KG4、Aradu.S9CWT的磷酸化評(píng)分值低于0.997，分別為0.925、0.994;蘇氨酸、酪氨酸最可能的磷酸化位點(diǎn)數(shù)都只有1個(gè)，且磷酸化評(píng)分值都低于0.990;在蔓花生AP2蛋白家族成員中，Aradu.387PF具有的潛在磷酸化位點(diǎn)數(shù)最多，磷酸化位點(diǎn)數(shù)占該家族氨基酸總數(shù)的14.99%;成員Aradu.A4KG4含有的潛在磷酸化位點(diǎn)數(shù)最少，磷酸化位點(diǎn)數(shù)占該家族氨基酸總數(shù)的8.02%;在AP2蛋白家族成員中，成員Aradu.SE6Q0的絲氨酸、蘇氨酸含量都是較高的，占比分別為8.65%、5.19%;成員Aradu.A4KG4的絲氨酸、蘇氨酸含量都是較低的，占比分別為3.38%、2.53%，酪氨酸含量最高，占比為2.11%;成員Aradu.42K79的酪氨酸含量最低，占比為0.19%（圖4）。

2.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

對(duì)蔓花生AP2蛋白家族成員進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，17個(gè)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為無(wú)規(guī)則卷曲最多，β-轉(zhuǎn)角最少，有14個(gè)成員的α-螺旋數(shù)>延伸鏈數(shù)，Aradu.GG3LG、Aradu.QYV19和Aradu.T7UUH這3個(gè)成員的延伸鏈數(shù)>α-螺旋數(shù)。總體而言，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則分散在各個(gè)氨基酸鏈中（圖5）。

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的17個(gè)成員進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)各成員三級(jí)結(jié)構(gòu)是否相似，可將該家族分為Ⅶ大類(lèi)，分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ類(lèi)表示。由圖6可以看出，第Ⅳ類(lèi)所含成員數(shù)最多，一共有5個(gè)，分別是Aradu.RG31X、Aradu.M2I8I、Aradu.SE6Q0、Aradu.G1CDJ和Aradu.42K79;其次是第Ⅰ類(lèi)，含有Aradu.0KI78、Aradu.387PF和Aradu.VJK1R這3個(gè)成員;第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ類(lèi)均含有2個(gè)成員，Aradu.GIP2Q、Aradu.QYV19屬于第Ⅱ類(lèi)成員，第Ⅲ類(lèi)成員有Aradu.A4KG4和Aradu.GG3LG，第Ⅴ類(lèi)成員有Aradu.C5HAC和Aradu.UA79E，第Ⅵ類(lèi)成員有Aradu.T7UUH和Aradu.S9CWT;第Ⅶ類(lèi)只有1個(gè)成員，為Aradu.GIP2Q。

2.7 蔓花生AP2基因家族編碼蛋白基序分析

對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白成員進(jìn)行Motif分析發(fā)現(xiàn)，Motif3、Motif4都含有1個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域，即YRG;Motif5含有RAYD結(jié)構(gòu)域（圖7）。YRG結(jié)構(gòu)域有利于DNA的結(jié)合，RAYD結(jié)構(gòu)域主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式元件結(jié)合[53]，說(shuō)明蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的Motif3、Motif4和Motif5屬于AP2結(jié)構(gòu)域。根據(jù)蔓花生AP2蛋白序列所含Motif類(lèi)型的不同，將該家族分為Ⅴ大類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)主要含有Motif1、Motif4和Motif8，其成員有Aradu.GG3LG、Aradu.UA79E、Aradu.S9CWT、Aradu.C5HAC、Aradu.T7UUH 和Aradu.VJK1R;第Ⅱ類(lèi)包括成員Aradu.M2I8I、Aradu.QYV19，都含有Motif1、Motif3、Motif4、Motif6、Motif7、Motif8;第Ⅲ類(lèi)主要含有Motif1、Motif2、Motif3和Motif5，成員有Aradu.EJI6Q、Aradu.387PF和Aradu.G1CDJ;第Ⅳ類(lèi)主要含有Motif1和Motif2，成員有Aradu.A4KG4和Aradu.SE6Q0;第Ⅴ類(lèi)主要含有Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6，成員有Aradu.42K79和Aradu.GIP2Q。在蔓花生AP2蛋白序列中，含有2個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列均含有Motif5，在蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的17個(gè)成員中，除Aradu.GIP2Q、Aradu.A4KG4不含有Motif1外，其他15個(gè)成員均含有Motif1;Motif2在該家族的15個(gè)成員中均存在，只有Aradu.QYV19、Aradu.GG3LG中不存在;有9個(gè)成員含有Motif3，14個(gè)成員含有Motif4，8個(gè)成員含有Motif5，說(shuō)明Motif1、Motif2和Motif4是蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的主要保守基序（圖8）。

2.8 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

通過(guò)對(duì)蔓花生AP2基因家族編碼蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的分組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該家族成員Aradu.GG3LG、Aradu.UA79E、Aradu.S9CWT、Aradu.C5HAC、Aradu.T7UUH和Aradu.VJK1R的親緣關(guān)系比該家族其他成員的親緣關(guān)系近。其中Aradu.GG3LG和Aradu.UA79E、Aradu.387PF和Aradu.G1CDJ、Aradu.A4KG4和Aradu.SE6Q0、Aradu.42K79和Aradu.GIP2Q這4組的組內(nèi)成員親緣關(guān)系更近（圖8），這與以擬南芥為探針的BLAST比對(duì)結(jié)果基本吻合（表1）。

落花生屬3個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以分為Ⅶ大類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)有9個(gè)成員，主要是蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的5個(gè)成員和野花生的4個(gè)成員;第Ⅱ類(lèi)有7個(gè)成員，主要是野花生AP2基因家族編碼蛋白的3個(gè)成員，蔓花生AP2基因家族編碼蛋白的3個(gè)成員及花生AP2基因家族編碼蛋白的成員Ahy016292，其中Araip.XB73L與Ahy016292的親緣關(guān)系相對(duì)較近;第Ⅲ類(lèi)有7個(gè)成員，野花生有3個(gè)， 蔓花生有2個(gè)，花生有2個(gè)，其中Araip.QQN2T與Ahy022503的親緣關(guān)系相對(duì)較近，Aradu.A4KG4與Araip.80H4B的親緣關(guān)系相對(duì)較近，Aradu.0KI78與Ahy008861的親緣關(guān)系相對(duì)較近;第Ⅳ類(lèi)有4個(gè)成員，分別是蔓花生的Aradu.42K79、Aradu.GIP2Q，野花生的Araip.L8K4F，花生的Ahy022725，其中Araip.L8K4F與Ahy022725的親緣關(guān)系相對(duì)較近;第Ⅴ類(lèi)有7個(gè)成員，分別是蔓花生的Aradu.M2I8I、Aradu.SE6Q0、Aradu.C5HAC，野花生的Araip.AXK3N、Araip.RB7C2，花生的Ahy015793、Ahy009871;第Ⅵ類(lèi)有5個(gè)成員，分別是蔓花生的Aradu.EJI6Q、Aradu.QYV19，野花生的Araip.SZ63C，花生的Ahy013042、Ahy017508;第Ⅶ類(lèi)與其他類(lèi)別的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，有2個(gè)成員都是野花生AP2蛋白家族成員，分別是Araip.N6C0B、Araip.E29R3（圖9-a）。

蔓花生AP2基因家族編碼蛋白和擬南芥AP2基因家族編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可分為Ⅴ類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)有11個(gè)成員的親緣關(guān)系相對(duì)較近，其中有7個(gè)是蔓花生的成員，4個(gè)是擬南芥的成員;第Ⅱ類(lèi)全是蔓花生的4個(gè)成員; 第Ⅲ類(lèi)只有1個(gè)成員，是蔓花生的Aradu.SE6Q0;第Ⅳ類(lèi)有14個(gè)成員，其中蔓花生有3個(gè)，擬南芥有11個(gè);第Ⅴ類(lèi)有17個(gè)成員，其中蔓花生有9個(gè)，擬南芥有8個(gè)，成員Aradu.77UUH與成員AT5G57390.1的親緣關(guān)系相對(duì)較近（圖9-b）。

對(duì)蔓花生與二穗短柄草等15個(gè)物種AP2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，蔓花生的Aradu.42K79與大豆的Glyma.12G073300.1.p親緣關(guān)系最近，與木豆的C.cajan.21449、蕓豆的Phvul.011G071100.1親緣關(guān)系較近，這與其同屬于豆科有關(guān)，但同為豆科的綠豆Vradi03g03260.1與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明綠豆該蛋白的進(jìn)化速度更快;二穗短柄草的Bradi2g37800.13.p與蔓花生的Aradu.42K79親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，可能與其分別為單雙子葉植物有關(guān)（圖10）。

3 討論與結(jié)論

目前，關(guān)于AP2轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究顯示，AP2亞家族主要參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，對(duì)花發(fā)育的調(diào)控研究得最多[37，54-58]，對(duì)根的生長(zhǎng)、果實(shí)和種子發(fā)育的調(diào)控作用也有研究[25，59]。吳彥慶等通過(guò)研究芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）分生組織決定基因AP[STBX]2[STBZ]發(fā)現(xiàn)，plAP2蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，非分泌蛋白[60]。阮先樂(lè)等對(duì)甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]AP2蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，AP2蛋白為不穩(wěn)定的、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性非分泌蛋白[61]。鄧?yán)说韧ㄟ^(guò)對(duì)‘紅陽(yáng)獼猴桃（Actinidia chinensis）AP2/EREB轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，該家族成員多為酸性氨基酸，是無(wú)信號(hào)肽的非分泌親水性蛋白[62]，這與本研究中蔓花生AP2蛋白的性質(zhì)基本吻合。芍藥的AP2蛋白主要在胞質(zhì)中起著生物學(xué)功能[60]，甘薯的大多數(shù)AP2成員亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核[61]。甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）AP2蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，其AP2蛋白多出現(xiàn)于細(xì)胞核中[63];喬永剛等通過(guò)對(duì)金銀花（Lonicera japonica Thunb.）AP2蛋白的亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白多在細(xì)胞核中[64];此外，新疆紫草[Arnebia euchroma （Royle） Johnst]的AP2蛋白也定位于細(xì)胞核中[65]。而本研究結(jié)果顯示，蔓花生AP2蛋白均定位在細(xì)胞核中，說(shuō)明AP2蛋白在不同植物中具有的作用和承擔(dān)的功能可能并不相同，但其最可能在細(xì)胞核中起著生物學(xué)作用。蓖麻的16個(gè)AP2成員以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲為其主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)[66]。郭慧等通過(guò)對(duì)甘藍(lán)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈?zhǔn)歉仕{(lán)AP2蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)[63]。文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）AP2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈組成[67]。楊樹(shù)（Populus trichocarpa）AP2蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主[68]。在本研究中，蔓花生AP2蛋白也是以無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈為主，說(shuō)明這3種二級(jí)結(jié)構(gòu)是AP2蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。

本研究結(jié)果表明，蔓花生AP2蛋白為不穩(wěn)定的親水性非分泌蛋白，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈為主，含有YRG、RAYD結(jié)構(gòu)域，花生屬的Araip.XB73L和Ahy016292、Araip.QQN2T和Ahy022503、Aradu.A4KG4和Araip.80H4B、Aradu.0KI78和Ahy008861、Araip.L8K4F和Ahy022725這5組組內(nèi)成員的親緣關(guān)系相對(duì)較近，蔓花生AP2成員Aradu.77UUH與擬南芥AP2成員AT5G57390.1的親緣關(guān)系最為接近。物種進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果顯示，蔓花生的Aradu.42K79與大豆的Glyma.12G073300.1.p親緣關(guān)系最近，與二穗短柄草的Bradi2g37800.13.p親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究和揭示AP2基因家族在蔓花生生長(zhǎng)發(fā)育、基因調(diào)控中的作用提供了一定的參考依據(jù)。

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收稿日期：2019-09-15

基金項(xiàng)目：四川省科技廳項(xiàng)目（編號(hào)：17ZZ019）;樂(lè)山師范學(xué)院人才啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：XJR17005）。

作者簡(jiǎn)介：王 玲（1999—），女，四川南充人，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：1981887804@qq.com。

通信作者：付 春，博士，講師，主要從事經(jīng)濟(jì)植物的生物信息學(xué)研究。E-mail：fuchun421@aliyun.com。