紅汁乳菇菌絲體液體發酵條件的優化研究

趙洪 李靜 向旭 高禮安 鄧功成

摘要：采用液體發酵技術和正交試驗方法，研究碳源、氮源、起始pH值和發酵時間等發酵條件對紅汁乳菇菌絲體干質量的影響，并對發酵條件進行優化。結果表明，紅汁乳菇菌絲體液體發酵條件的較優組合為碳源為馬鈴薯粉，濃度為3%;氮源為酵母膏，濃度為0.3%;起始pH值為6.0;發酵時間5 d。在27 ℃條件下，該組合菌絲體干質量最高，為10.094 g/L。

關鍵詞：紅汁乳菇;菌絲體;液體發酵;工藝優化;正交試驗

中圖分類號： S646.04? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0167-03

紅汁乳菇（Lactarius hatsutake），別稱紫菌、松毛菌，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactartus）大型真菌[1]。紅汁乳菇為菌根食用菌，目前尚不能人工栽培。紅汁乳菇菌絲體可以與馬尾松等植物形成菌根[2]，對松樹的生長有促進作用，可提高松樹抗環境脅迫能力已得到普遍認同。有研究者對紅汁乳菇子實體的生境及發生規律開展了調查和研究[3-5]，對其子實體的營養成分進行了測定[6]。筆者所在研究團隊對紅汁乳菇菌絲體的營養特性和單因子生長條件等進行了研究[7-8]。采用液體發酵技術是獲得紅汁乳菇菌絲體和發酵產物的重要手段，探索液體發酵條件對紅汁乳菇菌絲體生長的影響，可為大規模的菌絲體生產提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 紅汁乳菇由黔南民族師范學院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養基 PDA培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。完全培養基（液體）配方：葡萄糖2.000%，蛋白胨0.200%，磷酸二氫鉀0.046%，磷酸氫二鉀0.100%，硫酸鎂0050%，維生素B1 0.003 mg/100 mL，pH值6.5。液體種子培養基配方同PDA培養基，但不加瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子制備 斜面種子（一級種）制備：將采集的新鮮子實體帶回實驗室，采用組織分離法獲得母種，經轉接獲得一級種。液體種子制備：用 250 mL 三角瓶，裝入100 mL液體種子培養基，在無菌條件下接入約5 mm×5 mm紅汁乳菇一級種1塊，置于恒溫振蕩培養箱內，于27 ℃，150 r/min條件下培養5 d，制成液體菌種。

1.2.2 紅汁乳菇菌絲體液體發酵單因子試驗

1.2.2.1 紅汁乳菇菌絲體的生長曲線 用250 mL三角瓶作培養容器，裝入100 mL完全培養基，常規高壓滅菌后，在無菌條件下接入10 mL液體菌種，置恒溫振蕩培養箱內，于27 ℃，150 r/min條件下培養，接種培養1 d后，每天取3瓶，測量菌絲體干質量和發酵液的pH值。

1.2.2.2 碳源篩選試驗 分別用山梨醇（單糖），麥芽糖、蔗糖（雙糖），玉米粉、馬鈴薯粉（多糖）代替完全培養基中的葡萄糖，篩選不同碳源對紅汁乳菇菌絲生長的影響。試驗共設6個處理（包括葡萄糖），3次重復。

1.2.2.3 氮源篩選試驗 分別用酵母膏、尿素、甘氨酸（有機氮），氯化銨、硫酸銨、硝酸銨（無機氮）代替完全培養基中的蛋白胨，篩選不同氮源對紅汁乳菇菌絲生長的影響。試驗共設7個處理（包括蛋白胨），3次重復。

1.2.2.4 發酵起始pH值試驗 采用完全培養基，設置pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等6個處理，3次重復，用10% NaOH和10% HCl調節pH值，觀測不同發酵起始pH值對紅汁乳菇菌絲生長的影響。

1.2.3 菌絲體液體發酵條件優化試驗 根據單因子試驗的結果，采用L9（34）正交試驗[9]，優化液體發酵條件。

1.2.4 試驗測定方法 發酵液用滌綸布過濾，放入60 ℃電熱恒溫干燥箱內烘48 h，用電子天平稱量菌絲的干質量;用精密pH試紙、pHS-25A型數字酸度計同時測定發酵液的pH值。

2 結果與分析

2.1 紅汁乳菇菌絲體液體發酵單因子試驗結果

2.1.1 紅汁乳菇菌絲體的生長曲線 以培養時間為橫坐標，菌絲干質量為縱坐標繪制菌絲體的生長曲線。由圖1可以看出，紅汁乳菇菌絲體的生長過程，基本上與種群在有限環境中連續增長的邏輯斯諦曲線相符合[10]，1～2 d為增長的開始期，2～3 d 為加速期，5～7 d為飽和期，5 d時菌絲干質量最高。因此，其菌絲體的液體培養時間為5 d即可。

液體發酵體系中pH值隨發酵時間的延長，由發酵初始時的6.5降至4左右（圖2），這可能是發酵代謝過程中產生的有機酸導致的。

2.1.2 碳源對紅汁乳菇菌絲體生長的影響 由表1可知，紅汁乳菇菌絲體對碳源的利用較廣，單糖、雙糖和多糖都可以利用。在供試的碳源中，對葡萄糖的利用最好，發酵液菌絲干質量最高，達 8.082 g/L;其次為馬鈴薯粉，發酵液菌絲干質量為7.391 g/L;山梨醇最差。對不同供試碳源處理的菌絲干質量進行方差分析可知，葡萄糖與麥芽糖、蔗糖、山梨醇等碳源差異顯著，但與馬鈴薯粉、玉米粉沒有顯著差異，若進行規模化生產，從經濟成本考慮可選擇馬鈴薯粉或玉米粉作為紅汁乳菇菌絲體液體發酵的碳源。

2.1.3 氮源對紅汁乳菇菌絲體生長的影響 由表2可知，紅汁乳菇菌絲體對供試的有機氮和無機氮都能利用。在供試的氮源中，對酵母膏的利用最好，發酵液菌絲干質量達7.155 g/L，其次為蛋白胨，對甘氨酸的利用最差。對不同供試氮源處理的菌絲干質量進行方差分析可知，供試的有機氮和無機氮的一些種類之間，發酵液的菌絲干質量差異不顯著，表明紅汁乳菇菌絲體對氮源的利用較廣泛。

2.1.4 發酵起始pH值對紅汁乳菇菌絲體生長的影響 由表3可知，紅汁乳菇菌絲體對發酵環境的pH值適應范圍較廣，液體發酵的起始pH值在 3.0～8.0都能生長。培養6 d后，發酵起始pH值為5.0的處理菌絲體的干質量最大，為7.283 g/L。這說明紅汁乳菇菌絲體在中性或偏酸性的環境中生長較好。

2.2 紅汁乳菇菌絲體液體發酵條件優化

根據單因子試驗結果，綜合考慮原料的成本，試驗選擇馬鈴薯粉作為碳源，酵母膏作為氮源。選擇馬鈴薯粉濃度（A）、酵母膏濃度（B）、pH值（C）、發酵時間（D）等4因子進行 L9（34） 正交試驗，用菌絲體干質量作為評價指標，對紅汁乳菇菌絲體液體發酵進行優化，試驗設計見表4。

從表5可以看出，處理9發酵條件組合的菌絲體干質量最高。表明菌絲液體發酵較為優化的發酵條件為A3B3C2D1，即碳源馬鈴薯粉濃度為3%，氮源酵母膏濃度為0.3%，起始pH值為6.0，發酵時間5 d。碳源馬鈴薯粉R=4.552，為最大，表明碳源對液體發酵菌絲體干質量的影響較其他發酵因子大，是影響紅汁乳菇菌絲體液體發酵干質量的關鍵性因子。

3 結論與討論

紅汁乳菇菌絲體液體發酵對碳源的利用較廣，葡萄糖是供試碳源中菌絲干質量最高的碳源，符合真菌對碳營養需求的一般特征，本試驗以馬鈴薯粉、玉米粉作供試碳源，雖菌絲干質量沒有葡萄糖高，但經統計分析其與葡萄糖無顯著差異，若進行規模化生產，從經濟成本考慮可選擇馬鈴薯粉或玉米粉作紅汁乳菇菌絲體液體發酵的碳源。紅汁乳菇菌絲體對氮源的利用較廣泛，對供試的有機氮和無機氮都能利用，對酵母膏的利用最好，其次為蛋白胨，可用它們作為紅汁乳菇菌絲體液體發酵的氮源。紅汁乳菇菌絲體對發酵環境的起始pH適應范圍較廣，但菌絲體在中性或偏酸性的環境中生長較好，說明紅汁乳菇菌絲體充分適應了我國南方酸性的土壤環境。

本研究表明，紅汁乳菇菌絲體液體發酵條件的較優組合為馬鈴薯粉作碳源，濃度為3%;酵母膏作氮源，濃度為0.3%;起始pH值為6.0;發酵時間為5 d。在27 ℃溫度條件下，菌絲體干質量最大，達10.094 g/L。

參考文獻：

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[8]鄧功成，趙 洪，高禮安，等. 紅汁乳菇菌絲體液態發酵條件研究[J]. 江蘇農業科學，2012，40（4）：238-240.

[9]李春喜，王志和，王林文. 生物統計學[M]. 2版.北京：科學出版社，2000.

[10]牛翠娟. 基礎生態學[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2015.

收稿日期：2019-08-23

基金項目：貴州省科學技術基金[編號：黔科合LH字（2014）7425]。

作者簡介：趙 洪（1968—），男，貴州甕安人，副教授，主要從事生態學教學和環境生態及資源開發研究。E-mail：732140126@qq.com。