APP／PS1 小鼠不同時期灰質體積變化與Aβ 沉積和學習記憶功能的相關性分析

張宇豪 ，金 昊 ，張秀峰 ，梁勝祥 ，柳維林 ，陶 靜 ，2，陳立典 ，2，3，4*

1 福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122；2 福建省康復技術協同創新中心，福建 福州350122；3 康復醫療技術國家地方聯合工程研究中心，福建 福州350122；4 國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建 福州350122

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）作為癡呆類疾病中發病率最高的疾病［1-2］，其臨床表現主要為學習記憶功能逐漸受損以及一般認知損傷癥狀，病理變化特征包括大腦體積萎縮、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積、神經纖維纏結以及神經元凋亡等［3］。 據統計，2015年全球癡呆癥患者約4 680 萬，每年新增 1 000 萬病例，2017 年僅美國就有 550 萬成年人患有 AD［4］。 因此，探究 AD 的發病機制，將有可能為臨床防治AD 提供可靠的理論依據。

大腦皮層灰質是人類思維活動的物質基礎，是大腦神經元聚集部位，調控機體各種活動的最高中樞。 有研究指出，內嗅皮質（entorhinal cortex，EC）和海馬（hippocampus，HP）是大腦參與學習記憶的關鍵結構［5-6］。 AD 患者大腦核磁共振成像結果顯示，其灰質體積只有正常受試者的70%～80%，萎縮明顯［7］。 AD 患者大腦內 Aβ 的產生會導致老年斑的形成、神經纖維的纏繞及神經元的死亡，并隨著時間的推移導致癡呆［8］。 APP ／PS1 轉基因小鼠動物模型是探究AD 病變機制常用的雙轉基因模型之一，目前關于APP／PS1 灰質體積變化與學習記憶功能的下降以及其Aβ 沉積的關系仍缺少較為完善的證據，因此本研究通過小動物磁共振掃描觀察APP／PS1 小鼠灰質體積變化特征，并采用Th-s 熒光染色檢測其Aβ 沉積，探討APP／PS1 小鼠灰質體積變化與學習記憶功能和Aβ 沉積之間的相關性，為該AD動物模型的病理特征及干預性實驗研究提供可靠的行為學和影像學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗共納入野生組（wild type，WT）和 APP／PS1 組 2 組小鼠，每組 36 只。 WT 組小鼠選用 C57-BL／6 小鼠，APP／PS1 組選用 APP／PS1 雙轉基因小鼠，2 組均分別由 2、6、12 不同月齡小鼠組成， 每組每個月齡小鼠12 只。 分批購買于南京大學南京生物醫藥研究院［批號：SCXK（蘇）2015-0001］。 實驗前，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）鑒定每組不同月齡小鼠DNA 基因型，然后在福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室飼養。所有動物實驗程序均按國家標準進行并經學校動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要實驗試劑和設備

Th-s 抗熒光衰減封片劑（中國索萊寶有限公司，S2110）；免疫熒光檢測試劑盒（上海一基實業有限公司，YJ1012576）；異氟烷（中國 RWD 生命科技有限公司，1602801）；多聚甲醛（中國 Biosharp 生物科技有限公司，BL539A）；Morris 水迷宮（中國上海市欣軟信息科技有限公司，XR-XM101）；7.0T 小動物磁共振儀（德國布魯克科技有限公司，70／20 USR）；徠卡熒光顯微鏡（德國LEICA 公司，DFC425C）。

1.3 實驗方法

1.3.1 Morris 水迷宮測試 Morris 水迷宮為直徑120 cm 的圓形水池，共分為4 個象限，其中東南角為象限1，順時針以此類推。 迷宮水深30 cm 左右，逃生平臺放置在3 象限， 為一直徑5 cm 的透明原型平臺，保持其在水面下2 cm 左右。 水迷宮上方正中配置1 個攝像頭，記錄小鼠游泳軌跡，為方便鏡頭精確捕捉小鼠影像，在迷宮水面鋪灑1 層白色塑料顆粒使水面與實驗灰黑色小鼠形成顏色對比。 實驗開始后，拉上水迷宮四周圍簾，以免外界光線干擾攝像機記錄小鼠游泳畫面。 Morris 水迷宮分別通過前4 d 的定位航行實驗和第5 天的空間探索實驗檢測2 組小鼠以空間為參考的學習記憶功能。

Morris 水迷宮定位航行實驗共進行4 d，通過小鼠尋找到逃生平臺的時間，檢測2 組小鼠的空間記憶學習能力。 第1 天，將小鼠從水迷宮第1 象限內側壁放入水中，測試90 s，其找到逃生平臺的時間即為此次逃避潛伏期，若90 s 內仍未找到，則逃避潛伏期記為90 s，并引導其找到逃生平臺，休息，適應學習平臺所在位置15 s，然后從第2 象限放入，4個象限依次進行定位航行測試。 第2 天從第2 象限放入，以此類推共進行4 d。 第5 天進行空間探索實驗測試，實驗開始前，去掉第3 象限的逃生平臺。 每只小鼠均從第1 象限放入，測試90 s，通過記錄比較其穿越原逃生平臺所在位置的次數，檢測其空間學習記憶的提取能力。

1.3.2 磁共振T2 加權成像掃描 采用7.0T 磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）進行 T2 加權成像（T2-weighted imaging）掃描。掃描前，用 1.5%的異氟烷對小鼠進行麻醉，同時監測呼吸情況，體感線圈為激發線圈，表面線圈為接收線圈。 檢測結束，用ITK-SNAP 軟件分析對應灰質體積。

1.3.3 Th-s 熒光染色檢測 使用3.0%異氟烷混合純氧將小鼠麻醉，從腹部向上打開胸腔，然后用止血鉗輕微夾住心臟，灌注針刺破左心室，依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，待小鼠全身抽搐、僵硬后斷頭取出完整腦組織放入多聚甲醛中，24 h 后進行石蠟包埋切片。用0.125%的 Thioflavine-s 溶液避光浸泡8 min。 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3 次，5 min／次，然后用封片劑封片，最后在顯微鏡下拍攝。 分析2 組不同月齡小鼠大腦雙側內嗅皮質和海馬內的Aβ 沉積情況。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 2 組小鼠學習記憶功能Morris 水迷宮檢測結果比較

見圖 1、表 1 和圖 2、表 2。

圖1 2 組小鼠逃避潛伏期Figure 1 Escape labency periods between two groups

表1 2 組小鼠逃避潛伏期比較（） 秒Table 1 Comparison of escape latency between two groups （）s

注：與 WT 組同月齡小鼠比較，1） P＜0.05。Note: Compared with WT group at the same month, 1) P＜0.05.

組別WT 組APP ／PS1 組月齡2 6 12 2 6 12 n 12 12 12 12 12 12第1 天48.41±15.13 59.76±13.81 63.70±20.78 51.52±11.86 65.41±12.63 78.36±11.01第2 天41.93±12.73 51.41±16.03 48.68±19.07 46.35±20.21 55.42±17.12 66.70±16.711）第3 天33.89±13.29 35.13±10.16 40.29±19.54 39.48±11.04 50.38±18.201）68.10±15.381）第4 天27.87±7.55 26.87±11.38 28.71±11.19 31.19±10.99 41.25±11.971）53.12±10.771）

圖2 2 組穿越平臺次數Figure 2 Times of crossing the platform between two groups

表 2 2 組穿越平臺次數比較（） 次Table 2 Comparison of times of crossing the platform between two groups （）times

表 2 2 組穿越平臺次數比較（） 次Table 2 Comparison of times of crossing the platform between two groups （）times

注：與 WT 組同月齡小鼠比較，1） P＜0.05。Note:Compared with WT group at the same month,1)P＜0.05.

組別 月齡n WT 組2 6 12 APP ／PS1 組2 6 12 12 12 12 12 12 12穿越平臺次數2.81±0.51 2.43±0.67 2.45±0.60 2.43±0.88 1.53±0.871）0.61±0.281）

2.2 2 組小鼠灰質體積T2W1 掃描檢測結果比較

見表3。

表 3 2 組小鼠灰質體積比較（）Table 3 Comparison of gray matter volume between two groups （）mm3

表 3 2 組小鼠灰質體積比較（）Table 3 Comparison of gray matter volume between two groups （）mm3

注：與 WT 組同月齡小鼠比較，1） P＜0.05。Note:Compared with WT group at the same month,1)P＜0.05.

組別 月齡n WT 組2 6 1 APP ／PS1 組2 2 6 1 2 12 12 12 12 12 12內嗅皮質3.48±0.14 3.53±0.19 3.64±0.34 3.45±0.15 3.09±0.171）2.60±0.131）海馬25.08±0.84 24.76±0.83 25.45±1.32 25.17±0.64 24.30±0.81 20.34±1.071）

2.3 2 組小鼠Aβ 沉積結果比較

對2 組小鼠大腦切片進行Th-s 熒光染色后，Aβ 沉積呈白色高密度熒光斑塊，見圖 3。 其中，2 組小鼠2 月齡時腦內均未檢測出 Aβ 沉積；APP／PS1組小鼠6 月齡內嗅皮質和海馬即可檢測到少量 Aβ沉積，而到12 月齡則可檢測出大量致密Aβ 斑塊。此病理性斑塊僅集中于海馬和內嗅皮質，其他腦區分布較少。 統計分析斑塊數量，結果見表4、圖4。

2.4 APP／PS1 小鼠灰質體積變化與學習記憶能力的相關性分析結果

相關性分析結果顯示，APP／PS1 小鼠的灰質體積萎縮與其對應的逃避潛伏期和穿越平臺次數分別呈負相關和正相關關系，見圖5、圖6。

圖3 2 組小鼠腦區Aβ 沉積情況Figure 3 Aβ deposition in brain area of mice between two groups

表 4 APP／PS1 小鼠 6 月齡和 12 月齡 Aβ 斑塊結果比較（）Table 4 Comparison of Aβ plaque of APP／PS1 group at 6 and 12-month-old （）

表 4 APP／PS1 小鼠 6 月齡和 12 月齡 Aβ 斑塊結果比較（）Table 4 Comparison of Aβ plaque of APP／PS1 group at 6 and 12-month-old （）

注：與 6 月齡 APP／PS1 組小鼠比較，1） P＜0.05。Note: Compared with APP／PS1 group at the 6th month,1) P＜0.05.

海馬區12.42±1.96 28.26±3.641）月齡6 月齡12 月齡n 12 12內嗅皮質區13.25±2.01 33.86±3.611）

圖 4 APP／PS1 小鼠 6、12 月齡 Aβ 斑塊結果比較Figure 4 Comparison of Aβ plaque of APP／PS1 group at 6 and 12-month-old

圖5 APP／PS1 小鼠灰質體積變化與逃避潛伏期的相關性分析Figure 5 Correlation analysis between changes in gray matter volume and escape latency in APP／PS1 group

圖6 APP／PS1 小鼠灰質體積變化與穿越平臺次數的相關性分析Figure 6 Correlation analysis betweer changes in gray matter volume and the number of crossing platforms in APP／PS1 group

2.5 APP／PS1 小鼠灰質體積變化與Aβ 沉積相關性分析

見圖7。

圖 7 APP／PS1 小鼠內嗅皮質、海馬體積與其 Aβ 沉積的相關性分析Figure 7 Correlation analysis between the entorhinal cortex and hippocampus volume and Aβ deposition in APP／PS1 group

3 討 論

本研究采用APP／PS1 雙轉基因模型小鼠作為AD 模型組，APP／PS1 雙轉基因小鼠攜帶與早發AD相關的人類淀粉樣前體蛋白瑞典型突變基因（APPSW）和外顯子 9 缺失的 PS1 基因（PS1 dE9），同WT 組實驗小鼠一致，均具有C57-BL／6 背景。C57BL／6 小鼠的生命周期大致可分為幼年期、成年期、中年期和老年期，分別對應1～3 月齡、3～6 月齡、10～15 月齡和 18～24 月齡［9-10］。 多數研究證實，APP／PS1 小鼠在6 月齡即會表現出學習記憶功能障礙，并出現神經退行性改變［11-12］，為探究 APP／PS1小鼠發病特征及其早期病變表現，本實驗分別選取2 月齡、6 月齡和12 月齡即小鼠幼年期、成年期與中年期進行實驗。

3.1 APP／PS1 轉基因小鼠學習記憶功能障礙可能發生于6 月齡

Mirros 水迷宮實驗結果顯示，與WT 組比較，APP／PS1 組2 月齡小鼠的行為學檢測結果無明顯區別，提示APP／PS1 小鼠早期無學習記憶功能障礙的表現。 與 WT 組同月齡比較，APP／PS1 組小鼠 6月齡時逃避潛伏期明顯增高，穿越平臺次數明顯降低，且APP／PS1 組12 月齡時這種差異表現得更加顯著，表明APP／PS1 小鼠的空間學習記憶功能障礙可能發生于6 月齡，且12 月齡時出現加重的情況，這與 TASDEMIR 等［13-14］研究結果一致。 這提示，對于該AD 模型的干預性實驗研究可以選擇在更早的時間采取干預措施以預防AD 的進展。

3.2 大腦灰質進行性萎縮可能導致AD 小鼠學習記憶功能障礙

本研究T2WI 序列掃描結果顯示，與WT 組比較，APP／PS1 組6 月齡小鼠內嗅皮質體積明顯縮小，12月齡小鼠內嗅皮質和海馬體積也均明顯萎縮，提示APP／PS1 小鼠大腦灰質具有時間進行性萎縮的病理表現。 這與AD 患者早期階段常出現的包括內嗅皮質和海馬在內的腦實質萎縮，且內嗅皮質和海馬的損傷程度常最為嚴重的研究結果一致［15-16］。 內嗅皮質和海馬是保證空間學習記憶功能正常的2 個重要腦區，內嗅皮質和海馬體積萎縮，導致空間學習記憶的定位與導航功能失常，引起AD 患者早期出現情景記憶損傷的情況［17-21］。 AD 患者腦區病理性變化最早出現的是內嗅皮質，而后逐漸累及海馬和大腦新皮質［22-24］。 內嗅皮質、海馬和海馬旁回在內的內側顳葉萎縮，被認為是AD患者灰質體積變化的主要特征［25］。 本研究結果顯示，APP ／PS1 組6 月齡小鼠海馬體積未發生明顯變化，這與REDWINE 等［26］研究發現 PDAPP 小鼠在 3～4 月齡時即出現海馬體積減少的結果不一致，這可能是由于核磁掃描序列參數、AD 模型小鼠的遺傳背景以及海馬體積的檢測方法不同所導致的。

此外，APP／PS1 組小鼠大腦灰質體積萎縮與其相應月齡的學習記憶功能相關性分析結果顯示：學習記憶功能與其灰質體積的進行性萎縮呈顯著負相關關系，大腦灰質體積萎縮越厲害，AD 學習記憶功能障礙越嚴重，這提示，AD 學習記憶功能障礙可能是由大腦灰質萎縮所導致。 這與有研究顯示AD患者內嗅皮質［27］、海馬體積［28］的萎縮程度與其認知功能具有一定相關性的研究結果一致。

3.3 Aβ 過度沉積可能導致AD 大腦灰質萎縮

本研究通過免疫熒光檢測2 組不同月齡小鼠Aβ 沉積情況，研究結果顯示，與 WT 組比較，APP／PS1 組6 月齡小鼠大腦內開始出現Aβ 沉積，到12月齡時AD 小鼠Aβ 沉積進一步增加，這表明，隨著月齡的增加AD 小鼠腦組織中Aβ 沉積逐漸增多。這提示，腦組織中Aβ 沉積是AD 患者的主要病理表現之一，它可能是導致AD 患者出現進行性記憶功能障礙的最初誘因，這與HAASS 等［29-30］研究結果一致。

相關性分析結果顯示，AD 小鼠灰質體積與其相應腦區的Aβ 沉積程度呈負相關關系，即灰質體積越小，Aβ 沉積越多。 這表明高水平的 Aβ 沉積和加劇的腦萎縮是AD 小鼠神經退行性的主要表現，這提示Aβ 沉積、灰質體積萎縮是認知功能障礙的主要原因之一。 這與 JACK 等［31-35］研究顯示腦組織內出現Aβ 沉積，其大腦海馬和皮質的萎縮程度也更高的結果一致。 有研究顯示，AD 模型小鼠大腦內的Aβ 沉積可能與神經元丟失和突觸減少有關，其可能誘導大腦灰質體積萎縮性及營養不良性神經元［36-37］，但有關于其具體作用機制的研究還較少，還有待于包括大腦神經功能連接以及分子生物學水平等方面在內更深入的研究。

4 小 結

本研究證實APP／PS1 小鼠存在時間依賴性的學習記憶功能障礙，且隨時間呈漸進性加重，這可能與大腦灰質進行性萎縮有關；AD 大腦灰質體積萎縮與Aβ 沉積有明確的相關性，Aβ 過度沉積可能是AD 大腦灰質體積萎縮的主要因素之一，但其具體機制尚未明確，今后還需進一步深入研究，探明具體作用機制為臨床防治AD 提供依據。