Napin啟動子特異性表達油菜BnGPAT9基因

邢 蔓，洪 波，張澤榮，張曦予，陳 拓，吳寧柔，官 梅，鄔賢夢，官春云，熊興華

(1.國家油料改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

甘藍型油菜作為重要的油料作物在世界各地廣泛種植，菜籽油不僅是食用油的主要來源，在化工、飼料及生物能源等領域也具有重要作用。我國油菜種植面積和產量居世界前列，有研究顯示，菜籽中含油量每增加1%相當于油菜種子增產2.5%左右[1]。由此可見，提高油菜種子含油量是增加油菜單位面積產量的一條重要途徑。油菜種子含油量指菜籽油脂含量多少，而油脂作為重要的能量物質以三酰甘油(TAG)形式貯藏，其合成主要分3個步驟，一是合成脂肪酸，主要在質體中進行；二是在細胞質中生成甘油三磷酸，作為形成三酰甘油的基本骨架；三是形成三酰甘油，發生場所為內質網，先后經過甘油三磷酸酰基轉移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAT)、磷脂酸磷酸水解酶(PAPase)、二酰甘油轉酰酶(DGAT)催化而成[2-6]。在催化三酰甘油形成中甘油三磷酸酰基轉移酶起著起始功能[7-8]，由此可見，在植物油脂形成中具有十分重要的作用。

目前，擬南芥中已經證實有10個GPAT家族基因，分別為ATS1與AtGPAT1～AtGPAT9。大量的研究結果更指向AtGPAT9在油脂生物合成中扮演重要角色[7，9]，具有GPAT活性， 而AtGPAT1～AtGPAT8與植物角質和木栓質的形成相關[10-12]。Shockey等[8]在擬南芥中敲除GPAT9基因，建立種子特異性GPAT9基因敲除系，來研究GPAT9在種子TAG生物合成中的作用，共鑒定出8個低含油量的GPAT9amiRNA系，含油量降低了26%～44%；通過qPCR定量分析GPAT9基因在種子中的表達，結果顯示，有2個擬南芥GPAT9amiRNA系GPAT9轉錄物減少了88%以上，表明GPAT9基因表達的降低會影響種子中TAG含量和組成。Singer等[13]研究結果進一步確認擬南芥中GPAT9是功能性GPAT酶，對底物酰基CoA更具偏好性，對GPAT9的區域特異性分析表明，這種酶催化的大多數酰化反應主要發生在sn-1位置，證實其在甘油三酯生物合成的肯尼迪途徑中發揮重要作用。油菜BnGPAT9基因已從甘藍型油菜克隆并進行初步研究[14-15]，從生物信息學角度分析顯示，油菜BnGPAT9基因具有GPAT9特有的活性位點，在進化過程中高度保守；基因表達分析發現該基因具有組織表達特異性，在種子中高表達。

油菜Napin啟動子基因表達具有種子特異性，只集中在種子部位表達。利用油菜Napin啟動子組織特異性可讓目的基因只在種子中特異表達，從而調控種子各項生理代謝活動，實現目的基因功能只在轉基因植株種子中表達調控。鄒敏等[16]克隆得到油菜Napin啟動子，選用EGFP(增強型綠色熒光蛋白)基因作為報告基因，在芥菜中深入研究油菜Napin啟動子功能，結果顯示油菜Napin啟動子驅動表達具有嚴格的種子表達特異性。近年來，利用Napin啟動子驅動目的基因，轉化受體植物，進而調控植物種子中油脂含量和脂肪酸組成成分的研究被大量報道。Clauss等[17]獲得了Napin啟動子驅動表達BnSCE3的轉基因油菜系，發現轉基因油菜種子中芥酸含量較野生型低了5%，半纖維素和纖維素含量比野生型種子高約30%，油菜籽重量、大小和含水量明顯高于野生型種子。Liu等[18]以油菜Napin啟動子為驅動，分別構建BnGPDH、BnGPAT、BnDGAT、ScGPDH和ScLPAAT基因的種子特異性表達載體，成功轉化煙草并實現過表達，結果顯示，能有效提高轉基因煙草種子的含油量3.61%～8.55%。GPAT9基因是GPAT基因家族真正參與TAG合成起始步驟的重要功能基因，為了進一步分析油菜中GPAT9基因對種子油脂含量的作用，本研究利用Napin啟動子驅動BnGPAT9在擬南芥種子中特異性表達，以期為油菜高含油量分子育種提供理論與實踐指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

油菜品種：甘藍型油菜(AACC)湘油15號；試驗用野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞型 (Columbia)，由湖南農業大學作物基因工程重點實驗室保存；試驗用農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為土壤農桿菌GV3101菌株，植物表達載體為pBI121載體。油菜品種來源于湖南農業大學油料作物研究所，試驗用菌株來源于湖南農業大學農學院熊興華老師實驗室，其余試劑從公司購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜基因組DNA、總RNA的提取及cDNA合成 根據植物基因組 DNA 快速抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)方法，從湘油15葉片中提取油菜基因組DNA，置于-20 ℃保存。根據北京全式金生物技術有限公司生產的TransZol Up試劑盒和TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒方法提取油菜總RNA及合成cDNA，置于-80 ℃保存。

1.2.2 基因克隆 根據熊興華等[19]和邢蔓等[14]對甘藍型油菜湘油15中Napin啟動子和BnGPAT9基因研究結果，分別克隆油菜Napin啟動子核心功能區域和BnGPAT9基因。采用Primer 5.0分別設計含有酶切位點的Napin啟動子和BnGPAT9引物。Napin-Fw：5′-CCCAAGCTTGTTCAAGCGAATGGCATACCG-3′(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點)和Napin-Rv：5′-CGCGGATCCTGTTTGTATTGATGAGTTTTGG-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點)。PCR反應體系(20 μL)：dNTP(2.5 mmol/L)2 μL， 10×Reaction Buffer 2 μL，引物(Napin-Fw/Rv)1 μL， HiFi高保真DNA聚合酶1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR程序： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 45 s， 51 ℃ 45 s， 72 ℃ 90 s，循環35次；72 ℃ 10 min。BnGPAT9-Fw：5′-CGCGGATCCGGCGATCGGAAGCGAG-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點)和BnGPAT9-Rv：5′-CGAGCTCGAAACACCACAAGGAACAAG-3′(下劃線為SacⅠ酶切位點)。 PCR反應體系(20 μL)：dNTP(2.5 mmol/L)2 μL， 10×Reaction Buffer 2 μL，引物(BnGPAT9-Fw/Rv)1 μL ，HiFi高保真DNA聚合酶1 μL，cDNA模板1 μL， ddH2O 12 μL。PCR反應程序： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環35次；72 ℃ 10 min。配制1.5%瓊脂糖凝膠，PCR產物經電泳檢測后回收單一目的條帶，將目的基因與pUCm-T載體相連，采用熱激法轉化大腸桿菌DH5α，所得陽性單克隆菌送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 植物表達載體構建 根據SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒方法分別提取pUCm-T-BnGPAT9和pBI121載體質粒，用SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切pUCm-T-BnGPAT9和pBI121載體質粒，電泳檢測后回收目的片段。T4DNA連接酶連接pBI121載體片段和BnGPAT9基因片段，25 ℃反應2 h，構建pBI121-BnGPAT9載體替換原載體上GUS基因。采用熱激法將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α，均勻涂布LB培養皿，含卡拉霉素(50 mg/L)，37 ℃過夜培養。挑選單菌落PCR檢測，提取陽性菌落pBI121-BnGPAT9載體質粒和pUCm-T-Napin載體質粒，Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切pUCm-T-Napin和pBI121-BnGPAT9載體質粒，電泳檢測后回收目的片段。T4DNA連接酶連接Napin基因片段和pBI121-BnGPAT9載體片段，構建pBI121-Napin-BnGPAT9表達載體替換原載體上CaMV35S啟動子基因。采用熱激法轉化大腸桿菌DH5α保存備用，方法與構建pBI121-BnGPAT9載體時相同。

1.2.4 農桿菌介導轉化擬南芥 配制YEB固體培養基，卡拉霉素和利福平濃度為50 mg/L，采用CaCl2凍融法將表達載體pBI121-Napin-BnGPAT9導入農桿菌GV3101，將轉化后的菌液均勻涂布在培養基上，恒溫28 ℃暗培養2～3 d，對陽性單克隆菌落用引物進行PCR鑒定，經鑒定陽性菌株置于-80 ℃冰箱保存備用。采用農桿菌花絮浸染法轉化擬南芥，將轉化后收獲的種子平鋪于含有卡拉霉素的1/2MS固體培養基上篩選T0，將T0植株種植于植物培養箱(溫度24 ℃，光周期16 h/8 h)，收獲T0種子后再次篩選，直到篩選到純合株系。從轉基因擬南芥植株葉片中提取總RNA，反轉錄成cDNA，用BnGPAT9和Napin引物對轉基因植物PCR檢測。

1.2.5 轉基因擬南芥種子中脂肪酸及含油量測定 收集野生型和T2轉基因擬南芥種子，置于烘箱105 ℃干燥2 h。稱量0.2 g干燥擬南芥種子，用電鉆徹底粉碎，根據Beermann等[20]對植物種子中脂肪酸處理分析方法，略有改動，然后進行氣相色譜分析。采用索氏抽提法測定擬南芥種子中含油量，每個樣3次重復，所得數據用Microsoft Excel 2007和GraphPad Prism 5處理分析。

2 結果與分析

2.1 Napin、BnGPAT9基因克隆

采用植物基因組 DNA 快速抽提試劑盒提取湘油15幼苗葉片基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過Napin-Fw、Napin-Rv引物PCR擴增出目的條帶(圖1-A)。采用TransZol Up試劑盒從油菜苗葉片中提取油菜總RNA，采用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將油菜總RNA反轉錄成cDNA，用引物BnGPAT9-Fw/Rv從油菜cDNA中擴增出目的條帶(圖1-B)。經測序顯示，克隆到BnGPAT9基因全長1 131 bp，Napin基因全長682 bp。

M.DNA 分子量(Trans2K)；1.Napin基因； 2.BnGPAT9基因。M.DNA Marker(Trans2K)；1.Napin gene；2.BnGPAT9 gene.

2.2 Napin啟動子序列分析

對克隆到的Napin啟動子進行PlantCARE在線分析，結果(表1、圖2)顯示克隆的Napin啟動子核心區域具有大量TATA-box和CAAT-box等特征元件，以及參與胚乳表達、分生組織表達、黃酮類生物合成、MYB結合位點、光應答、脫落酸誘導等多個元件。其中脫落酸誘導元件(ABRE)是Napin啟動子種子特異性表達必不可少的元件，在種子成熟階段起調控作用[21]。GCN4基序比較保守，是調控胚乳儲存蛋白基因啟動子的重要元件[22]。分析結果表明，克隆的Napin啟動子包含多種調控元件，具備種子特異性表達功能。

表1 啟動子調控區元件分析Tab.1 Cis-acting regulatory element analysis of promoter sequence

圖2 Napin啟動子序列和順式作用元件Fig. 2 Sequence of Napin and the cis-acting regulatory elements

2.3 pBI121-Napin-BnGPAT9表達載體構建

根據1.2.3試驗方法構建pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達載體(圖3)。首先，SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切pUCm-T-BnGPAT9和pBI121載體質粒，用BnGPAT9基因替換GUS基因，構建pBI121-BnGPAT9重組質粒(圖3-A)。隨后，改用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ快速內切酶，采用同樣的方法酶切pUCm-T-Napin和pBI121-BnGPAT9載體質粒，用Napin基因替換CaMV35S啟動子基因，構建pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達載體(圖3-B)。采用熱激法將pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達載體轉化大腸桿菌DH5α，經PCR檢測后保存陽性菌落，檢測結果見圖4。

圖3 pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達載體構建過程Fig.3 Flow chart for construction of the pBI121-Napin-BnGPAT9 plant expression vector

M.DNA 分子量(Trans2K)；1，2.Napin基因；3，4.BnGPAT9基因。M.DNA Marker(Trans2K)；1，2.Napin gene；3，4.BnGPAT9 gene.

2.4 擬南芥轉基因植株檢測

經農桿菌花絮浸染法轉化擬南芥，篩選得到2株T0轉基因苗，所得轉基因苗分別用引物BnGPAT9-Fw/Rv和Napin-Fw/Rv進行PCR鑒定，cDNA擴增結果如圖5所示，轉基因植株中均能同時檢測到Napin、BnGPAT9目的條帶，表明已經得到轉pBI121-Napin-BnGPAT9擬南芥植株。繼續篩選純合體株系，直到T2全為抗性苗，表明已經篩選出轉基因純合株系。

2.5 種子中脂肪酸組分分析

由表2可知，在擬南芥種子中特異性表達BnGPAT9基因能改變種子中脂肪酸組成成分，提高油酸(C18∶1)含量，降低亞油酸(C18∶2)和芥酸(C22∶1)含量。與野生型對照相比，轉基因株系1的C18∶1含量提高1.01百分點，株系2的C18∶1含量提高了0.70百分點，統計分析顯示株系1與對照差異顯著，株系2差異不顯著；轉基因株系1和2的C18∶2含量分別低于對照0.70，0.93百分點，差異顯著；C22∶1含量與對照相比也有所下降，株系2顯著低于對照；C16∶0、C18∶0、C18∶3、C20∶0、C20∶1和C20∶2含量與野生型相比無顯著差異。由此看來，BnGPAT9基因對種子中脂肪酸合成具有明顯調控作用，通過種子中集中表達可改變種子中脂肪酸組成成分。

M.DNA 分子量(Trans2K)；1，2.野生型植株Napin、BnGPAT9基因；3，4.株系1 Napin、BnGPAT9基因；5，6.株系2 Napin、BnGPAT9基因。

表2 擬南芥種子中脂肪酸組成Tab.2 Arabidopsis thaliana seeds fatty acid composition %

2.6 擬南芥種子含油量分析

擬南芥種子含油量測定結果顯示(圖6)，野生型擬南芥種子中含油量為25.05%，株系1含油量為27.61%，株系2含油量為26.96%，2個轉基因株系種子含油量均顯著高于野生型，其中株系1含油量提高了2.56百分點，株系2提高了1.91百分點。種子中特異性表達BnGPAT9基因對增加種子含油量效果顯著，表明在Napin啟動子調控下BnGPAT9基因在種子油脂合成中發揮重要作用。

不同小寫字母表示種子含油量間差異達到顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters represent significant difference between the oil content in Arabidopsis seeds(P<0.05).

3 結論與討論

油菜Napin啟動子具有種子表達特異性，已在煙草、擬南芥、芥菜、油菜等作物中深入研究，Napin啟動子在種子中調控外源基因表達，調節脂肪酸合成，提高種子含油量等方面發揮著重要作用[16-18，23-24]。GPAT9基因在擬南芥中研究最為透徹，證實該基因為GPAT基因家族參與TAG合成的功能基因，能調控植物TAG生物合成進而影響含油量[8，13]。甘藍型油菜BnGPAT9基因已被克隆研究，參與植物油脂合成過程[14-15]，然而該基因在種子含油量方面的作用還未見報道。本研究對油菜Napin啟動子和BnGPAT9基因進行克隆，在線分析顯示，該Napin啟動子具備種子特異性功能，并成功構建pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達載體轉化擬南芥。

擬南芥種子中脂肪酸組分分析顯示，Napin啟動子調控BnGPAT9基因表達能改變種子中脂肪酸組成成分，使得轉基因株系C18∶1含量提高，C18∶2和C22∶1含量降低。推測BnGPAT9在作用合成底物時更趨向C18∶1-CoA， Singer等[13]研究結果也顯示GPAT9對C18∶1-CoA顯示出較高的酶活性，可能這種對底物的選擇性導致對C18∶2和C22∶1的偏好性較弱，因此含量有所降低。株系1和株系2種子含油量分別顯著提高2.56，1.91百分點，表明在種子中集中表達BnGPAT9基因有助于提高種子含油量，進一步證實BnGPAT9是油脂合成的重要基因。

油菜Napin啟動子廣泛應用于油料作物種子中油脂成分的改良，利用Napin啟動子種子表達特異性，成功實現在種子中調控目的基因表達，在改善脂肪酸組分和提高種子含油量方面具有重要作用[17-19，25]。本研究在擬南芥種子中特異性表達BnGPAT9基因提高了種子含油量，推測Napin啟動子在種子部位定時、定點、高效調控BnGPAT9基因表達，降低BnGPAT9在根莖葉等組織中的表達程度，減少不必要的能量損失，可實現在種子中集中表達。甘藍型油菜與擬南芥同為十字花科植物，且BnGPAT9基因與擬南芥GPAT9同源性很高，進化過程中也高度保守[14-15]，因此，本研究可為BnGPAT9基因在改良和提高油菜籽油脂含量方面提供參考。