大豆二酰甘油酰基轉移酶基因GmDGAT1A啟動子的克隆與功能分析

晁毛妮，胡喜貴，張晉玉，王潤豪，溫青玉，孫新凱，黃中文

(1.河南科技學院，現代生物育種河南省協同創新中心，河南 新鄉 453003；2.河南省農業科學院，河南 鄭州 450002)

大豆是我國重要的油料作物，也是重要的植物油來源，其種子油脂含量和脂肪酸組分對大豆品質具有重要影響[1]。油酸和亞油酸是大豆種子油脂中對人體有益的不飽和脂肪酸，在預防高血壓和心臟病等方面具有重要作用，而亞麻酸易于氧化，容易使油脂變質[2-3]。因此，在大豆品質育種中，提高大豆種子油脂含量尤其是油酸和亞油酸含量，同時降低亞麻酸含量已成為研究的熱點。

三酰甘油(TAG)是油料作物油脂積累和儲存的主要形式，對植物種子油脂的形成十分重要[4-8]。二酰甘油酰基轉移酶(DGAT)是催化TAG生物合成的關鍵酶，在TAG的合成和積累過程中具有重要調控作用[9]。目前，已發現4種類型的DGAT，包括DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和可溶性的DGAT[10]，其中DGAT1研究得最為深入，已在旱金蓮[11]、甘藍型油菜[12]、大豆[13]、玉米[14]和煙草[15]等多個物種中被克隆和研究。研究表明，DGAT1是TAG積累的主要貢獻者，在植物中主要影響種子的含油量[16-21]。例如，將旱金蓮TmDGAT1基因分別轉入擬南芥、油菜和高芥酸油菜，可使其干種子含油量提高3.5%～10%[11]；在玉米中，過表達DGAT1不僅可以提高玉米種子的含油量，還改變了種子油脂的組成[14]。相反地，在擬南芥DGAT1突變體植株中，種子含油量下降20%～40%[22]。關于大豆DGAT的研究發現，大豆中共存在10個DGAT基因，其中包含3個DGAT1基因[23]。進一步將GmDGAT1A在擬南芥中進行過表達，可使轉基因種子含油量提高15.4%～21.7%[24]，表明大豆GmDGAT1A基因在提高植物種子含油量方面具有很大潛力。因此，研究大豆GmDGAT1A基因的表達調控，不僅有助于深入了解其表達調控的分子機制，也可為通過改變GmDGAT1A表達水平，提高大豆種子油脂含量提供一種新途徑。

啟動子是RNA聚合酶能夠識別與結合，進而啟動基因轉錄的一段DNA序列，對基因的表達調控至關重要，決定了基因的表達模式和強度[25-26]。另外，啟動子區具有很多重要的調控元件，包括響應于非生物脅迫、植物激素和光照等，它們可以通過響應外界環境條件來調控下游基因的表達，增強植物對外界環境的適應性[26-28]。因此，研究基因的啟動子，對于增強植物的抗逆性和對外界環境的適應性等也具有重要意義。GmDGAT1A是大豆油脂代謝過程中的一個關鍵基因，目前對于GmDGAT1A表達特性和功能已開展一些研究[13，29]，但是關于該基因表達調控的分子機制還知之甚少。本研究對大豆GmDGAT1A啟動子進行克隆，并對其順式作用元件進行分析，另外，又進一步構建了含有報告基因GUS的植物表達載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A，并通過轉化擬南芥和GUS組織化學染色來研究其功能，旨在探究油脂代謝基因表達調控的分子機制，并為通過基因工程提高大豆種子油脂含量提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗材料為大豆品種科豐1號，由南京農業大學國家大豆改良中心提供，用于GmDGAT1A啟動子的克隆。

1.2 大豆基因組DNA的提取

以大豆葉片為試驗材料，使用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP321)，按照試劑盒說明書操作步驟進行大豆基因組DNA的提取，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取的質量。

1.3 GmDGAT1A啟動子的擴增

根據GmDGAT1A啟動子的序列信息，利用Primer 5.0設計特異性引物，引物序列：pGmDGAT1A-F1：GACCTAAACCGATAACCAAAGAA，pGmDGAT1A-R1：AACCTGACGGAAAATGGTGTC。PCR擴增反應體系包括25 μL 2 × Phanta Max Buffer (Mg2+plus)，1.0 μL dNTP Mix (10 mmol/L each)，正、反向引物(10 μmol/L)各2 μL，1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，P505-d1)，2.5 μL DNA 模板和16.5 μL ddH2O，共計50 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，34個循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定為目的基因的PCR產物經膠回收試劑盒(Axygen，AP-GX-4)回收后送華大基因公司進行測序。

1.4 GmDGAT1A啟動子序列分析

利用植物順式作用元件數據庫PlantCare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行GmDGAT1A啟動子區順式作用元件的預測。

1.5 GmDGAT1A啟動子表達載體的構建

選用無啟動子、含有GUS基因的pCAMBIA1381Z作為表達載體，利用雙酶切方法構建融合表達載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A。首先根據啟動子序列設計含有酶切位點和保護堿基的上下游引物，上游引物為pGmDGAT1A-F2：5′-CGCGGATCCGACCTAAACCGATAACCAAAGAA-3′，下劃線為酶切位點BamH Ⅰ；下游引物為pGmDGAT1A-R2：5′-AAACTGCAGTGGAAAAGAAGACCGAGCG-3′，下劃線為酶切位點為PstⅠ。以測序正確的膠回收產物為模板進行PCR擴增，反應體系和擴增程序同上所述。使用BamH Ⅰ和PstⅠ限制性內切酶對PCR產物和pCAMBIA1381Z空載體質粒分別進行酶切，電泳后的膠回收產物用T4連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，并涂布在含有卡那霉素的LB固體培養基上。挑選單克隆進行菌液PCR，陽性菌液提取質粒后進行酶切驗證，含有目的基因片段的菌液送深圳華大基因公司進行測序。

1.6 農桿菌介導的轉化及轉基因植株的鑒定

采用農桿菌介導的蘸花法[30]將上述表達載體轉化野生型擬南芥(Cloumbia-0)，獲得T0轉基因種子。將T0種子種在含有潮霉素抗性的固體培養基上進行篩選，經抗性篩選長出的植株為T1植株，待其長出2片真葉后移栽到蛭石中，并置于光照培養箱(22 ℃，光16 h/暗8 h)中進行培養。于幼苗期取T1轉基因植株的葉片，用于進一步的PCR檢測，PCR檢測所用引物序列：pGmDGAT1A-F3：5′-GACCTAAACCGATAACCAAAG-3′，pGmDGAT1A-R3：5′-TGGAAAAGAAGACCGAGCGAGC-3′。PCR檢測為陽性的植株于成熟期收獲T1種子。采用同樣的方法繼續對T1種子進行抗性篩選，收獲的T2種子用于后續的GUS組織化學染色分析。

1.7 GUS組織化學染色

擬南芥幼苗和處于成熟期擬南芥植株的根系、葉片、莖和角果等組織的GUS染色參照Jefferson等[31]方法并略加修改。首先，取待染色的各組織，加入GUS染色液；接著，置于37 ℃溫育24 h；然后，用70%乙醇進行脫色，直至底色完全消失；最后在體視鏡(AXIO Zoom.V16，蔡司)下觀察染色結果并拍照。

2 結果與分析

2.1 大豆GmDGAT1A啟動子的克隆

用已克隆的GmDGAT1A基因ID號(Glyma.13G106100/Glyma13g16560)檢索大豆基因組數據庫，得到其ATG上游約2 000 bp的啟動子序列。然后，在該啟動子序列上下游約500 bp范圍內設計1對特異性引物，并以大豆品種科豐1號DNA(圖1-A)為模板，擴增大豆GmDGAT1A啟動子。根據上下游引物的位置可知，擴增片段的理論大小為2 495 bp。由圖1-B可以看到，PCR產物電泳檢測結果與預期片段大小相符。PCR產物經測序后，與大豆基因組數據庫參考序列進行Blast比對，結果表明，擴增片段包含GmDGAT1A基因ATG上游2 192 bp的啟動子序列，且與大豆基因組參考序列一致，表明本研究已成功克隆GmDGAT1A的啟動子pGmDGAT1A。

圖1 大豆基因組DNA的提取(A)及GmDGAT1A啟動子的擴增(B)Fig.1 The extraction of genomic DNA (A) and PCR amplification of GmDGAT1A promoter (B) in soybean

2.2 大豆GmDGAT1A啟動子的序列分析

對已克隆的pGmDGAT1A進行順式作用元件預測分析發現，該啟動子包含有TATA-box和CAAT-box等啟動子所必需的基本順式作用元件，另外還含有7個參與光響應的順式作用元件(G-box、LAMP-element 、TCT-motif和Box 4)，4個參與脫落酸響應順式作用元件(ABRE)，1個參與赤霉素響應的順式作用元件(GARE-motif)，以及一些像MYB、ERE、AAGAA-motif和Myc等功能未知的順式作用元件(表1)。這些結果表明，GmDGAT1A的表達可能受光、赤霉素和脫落酸等多種環境條件的影響。

2.3 大豆GmDGAT1A啟動子表達載體的構建

利用雙酶切法將克隆的啟動子片段pGmDGAT1A連接到植物表達載體pCAMBIA1381Z(有GUS，無啟動子)上。將構建好的植物表達載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A轉化大腸桿菌DH5α后挑選陽性克隆測序，序列比對結果正確。進一步利用限制性內切酶BamH Ⅰ和PstⅠ進行酶切驗證，結果表明，表達載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A可被切為2個片段，分別為2 192 bp的目標基因片段和載體片段，且載體片段與pCAMBIA1381Z空載體酶切片段的大小一致(圖2)，表明表達載體構建成功。

表1 大豆GmDGAT1A啟動子區的順式作用元件Tab.1 Cis-acting elements in promoter of GmDGAT1A in soybean

2.4 轉基因擬南芥陽性植株的鑒定

將pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A表達載體通過農桿菌介導法轉化擬南芥，成熟后收獲T0轉基因種子。對T0轉基因種子用含有潮霉素的MS培養基進行抗性篩選后，進一步對T1擬南芥幼苗進行基因組DNA提取和PCR檢測。結果表明，T1轉基因擬南芥幼苗和陽性對照(表達載體質粒)均能擴增到2 192 bp的GmDGAT1A啟動子片段，而陰性對照(野生型擬南芥)擴增不到目標條帶(圖3)，表明被檢測的T1轉基因擬南芥幼苗為陽性植株，成熟后收獲T1轉基因種子。T1轉基因種子經潮霉素抗性篩選和PCR檢測后，于成熟期收獲T2種子，用于后續的功能分析。

M.Marker；1.pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A表達載體；2：空載體(pCAMBIA1381Z)。M.Marker；1.pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A expression vector；2.Empty vector(pCAMBIA1381Z).

2.5 大豆GmDGAT1A啟動子的功能分析

對轉pGmDGAT1A擬南芥植株各組織進行GUS組織化學染色，結果表明，pGmDGAT1A驅動的GUS主要在轉基因擬南芥幼苗的葉脈(圖4-A1-A2)和根(圖4-A1、A3-A4)中表達，在主根和側根的根尖部分(圖4-A3-A4)不表達；在成熟期轉基因擬南芥植株中，葉脈(圖4-B1)、成熟的根(圖4-B3-B4)、角果內的隔膜和珠柄(圖4-B5-B9)GUS染色較深，而莖(圖4-B2)和發育的種子(圖4-B10-B12)未染色。這些結果表明，pGmDGAT1A驅動的GUS主要在擬南芥的根、葉脈以及角果內隔膜和珠柄中表達。

M.Marker；1.表達載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A質粒(陽性對照)；2.野生型擬南芥(陰性對照)；3-10.轉基因擬南芥。M.Marker；1.Expression vector pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A(Positivecontrol)；2.Wild Arabidopsis thaliana (Negative control)；3-10.Transgenic Arabidopsis thaliana.

A1-A4.轉pGmDGAT1A擬南芥幼苗(A1)及其葉片(A2)、側根(A3)和主根(A4)對應位置放大圖；B1-B12.成熟期轉pGmDGAT1A擬南芥植株的葉片(B1)、莖(B2)、根(B3)、根對應位置放大圖(B4)、角果(B5-B9)、發育的種子(B10)和種子對應位置放大圖(B11-B12)。A1-A4.pGmDGAT1A transgenic Arabidopsis thaliana seedlings (A1) and enlarged view of its leaf (A2)，lateral roots (A3) and main roots (A4)；B1-B12.The leaf (B1)，stem (B2)，roots (B3)，enlarged view of roots (B4)，silique (B5-B9)，seeds (B10)and enlarged view of seeds (B11-B12) in mature pGmDGAT1A Arabidopsis thaliana.

3 結論與討論

植物種子中的油脂是人類重要的食用油來源，也是重要的工業原料。目前，關于油脂代謝的生化途徑及相關基因的功能已比較清楚，但其調控機理尚不明確[32-33]。啟動子作為基因表達調控的重要元件，在基因的表達調控中具有重要作用[34]。為了解大豆油脂代謝重要基因GmDGAT1A表達調控的分子機制，本研究對大豆油脂代謝基因GmDGAT1A啟動子進行克隆和序列分析，結果發現，GmDGAT1A啟動子區除具有基本的順式作用元件外，主要還包括一些響應于光、脫落酸和赤霉素等順式作用元件。許多研究表明，脫落酸是調控種子發育、成熟和休眠的重要內源激素[35]，對于油籽脂肪酸含量和組分具有影響[36-38]。例如，在油菜中，噴施脫落酸可通過抑制脂肪酸碳鏈延長基因FAE1的表達，影響芥酸等超長鏈脂肪酸合成，進而促進不飽和脂肪酸含量的增加和蛋白質含量下降[38]。與脫落酸功能不一樣的是，赤霉素具有促進種子萌發的作用[39]。由于種子在萌發過程中需要消耗油脂等營養物質來滿足種子萌發和幼苗形態建成所需的能量，因此，赤霉素有利于種子油脂消耗而不利于油脂的積累[40]。進一步研究發現，赤霉素信號途徑主要是通過抑制DELLA蛋白的表達，從而上調與種子脂肪分解相關的SFARs類GDSL脂酶基因的表達，最終抑制種子中油脂的積累[41]。在本研究中，大豆油脂合成的關鍵基因GmDGAT1A啟動子區具有脫落酸和赤霉素響應元件，表明大豆種子油脂的積累可能與其他植物一樣也受植物激素脫落酸和赤霉素的影響，它們可能通過啟動子在轉錄水平調控油脂代謝相關基因的表達，從而影響大豆種子中油脂的合成與分解。有趣的是，與赤霉素響應元件相比，GmDGAT1A啟動子區具有較多拷貝的脫落酸響應元件。一方面，脫落酸對于油籽種子中脂肪酸含量的積累有促進作用[36-39]；另一方面，有研究表明，啟動子區順式作用元件的數目可能會影響基因表達的強度和誘導特性[42]。目前還不清楚脫落酸響應元件ABRE是如何調控下游基因GmDGAT1A表達和強度，以及脫落酸在大豆種子油脂合成中的作用。因此，在今后的研究中仍需通過啟動子功能區的缺失分析等來進一步確定參與基因表達調控的重要元件及對基因表達強度的影響。

目前，關于DGAT1基因的組織表達特性研究已有較多報道，普遍認為DGAT1基因在植物的許多組織均有表達，且在不同植物中DGAT1基因的表達模式存在很大差異。例如，旱金蓮DGAT1基因僅在種子中表達[11]，蓖麻DGAT1基因在各個組織表達水平接近[43]。在大豆中，GmDGAT1A基因在種子中表達量最高，在根、葉、莖、花和莢等組織也有較高的表達，且在不同發育時期種子中的表達規律與油脂含量積累規律一致[13]，暗示著其在大豆種子油脂積累中起著重要作用。先前研究表明，基因的表達模式主要受上游啟動子的表達調控，為了探究GmDGAT1A的組織特異性表達模式是否由于其上游啟動子的調控，本研究進一步通過擬南芥轉化來探究大豆GmDGAT1A啟動子的功能。對大豆GmDGAT1A啟動子的功能進行研究發現，GmDGAT1A啟動子驅動的GUS在擬南芥的根、葉片的葉脈中具有較高的表達，這與先前研究表明GmDGAT1A基因在根和葉中具有較高表達量的結果較為一致[13]；而在擬南芥的角果中，GmDGAT1A啟動子驅動的GUS主要在角果內的隔膜和珠柄中表達，在發育的種子中表達量很低。擬南芥角果內珠柄的主要功能是為擬南芥種子的發育提供營養通道[44]，GmDGAT1A啟動子驅動的GUS在擬南芥角果內的隔膜和珠柄中的高表達，表明轉基因擬南芥種子中油脂的積累可能主要通過在其他地方合成并通過營養通道運輸來完成。由于擬南芥角果的構造和發育規律與大豆莢果可能存在差異，因此，有必要在大豆中進一步通過GUS組織定位來探究GmDGAT1A啟動子驅動的目標基因在莢果內的表達情況，從而為深入了解GmDGAT1A啟動子的功能奠定基礎。