象草葉片和莖稈木質素合成相關基因的表達模式分析

付程程，黃淮安，周夢蝶，鐘天秀，張向前，陳 曙，解新明

(華南農業大學 林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642)

木質素是一種酚類聚合物，是植物體內含量僅次于纖維素的有機高分子物質，占地球生物圈有機碳的30%左右[1]。在形成細胞壁的過程中，木質素起很重要的作用，它主要存在于木質部中，通過形成交織網使細胞壁更加堅固[2]，從而保護植物免受真菌侵害，給植物提供機械支撐，維持良好的硬度，承受整株植物的重量[3-4]。在陸生植物的進化過程中，木質素與植物的直立生長習性息息相關，其合成過程也是逐漸適應陸地生存的特征之一[5]。木質素不容易被食草動物消化，含量的高低可影響飼草的吸收效率和營養價值[6]。研究表明，木質素主要是由3種單體組成，分別是芥子醇、香豆醇和松柏醇，三者都是由苯丙烷衍生物通過不同的羥基化和甲基化形成的，再經化學鍵連接[7]。在不同的植物種類中，3種木質素單體所占比例皆不相同，G-S型木質素主要由松柏醇與芥子醇聚合而成，存在于雙子葉植物；G型木質素主要由松柏醇聚合而成，存在于裸子植物與蕨類植物；H-G-S型木質素不同程度地包含著這3種木質醇單體，主要是單子葉植物[8]。研究這3種木質素單體形成過程中的關鍵酶基因的作用是當前研究的熱點，很多研究者分析木質素與植物的抗性關系都是從木質素合成關鍵酶出發，但是由于過程中涉及的酶類眾多，對于木質素的研究還有很長的路要走[9]。

象草(PennisetumpurpureumSchum)屬禾本科，是一種原生于非洲草原的多年生草本植物[10]。稈直立，高可達3 m以上，是生物量最高的草本植物之一，最高可達90 t/hm2，同時被認為是最優秀的能源物質之一[10-11]。早在20世紀30年代，象草便從緬甸引入中國[12]。象草適應力強，適口性良好，已成為中國華南地區重要的牧草之一。除此之外，因其抗逆性強、熱值高、生物量大、產量高等特點，所以也常常被用作造紙原料和新型生物能源作物[13-16]。近年來對象草木質素合成調控的研究相繼展開。2014年，彭小群等[17]通過構建了PpCCR正義和反義載體，并利用農桿菌轉化法轉化到煙草中，發現PpCCR過表達煙草轉基因煙草木質化細胞增多，而反義表達的煙草轉基因煙草木質化細胞排列松散，筆者得出PpCCR在象草木質素合成中發揮很重要的作用，也為今后研究象草遺傳改良奠定了基礎。2015年，唐然等[18]對華南象草CAD基因進行克隆，構建表達載體在煙草中異源表達，證明了PpCAD基因參與植物木質素的合成過程，對繼續研究象草木質素合成調控打下基礎。鐘天秀等[11]同樣對華南象草中的Pp4CL基因進行克隆，并在煙草中異源表達，發現轉基因煙草的木質素在葉柄和莖稈中有不同程度的提高，表明過表達Pp4CL基因能夠顯著提高植株木質素的含量。這些研究結果都為華南象草木質素改良工作打下了基礎。

本研究以N51象草為試驗材料，測定莖稈(以下簡稱為：倒一節間、倒三節間、倒五節間)和葉片(以下簡稱為：倒一葉、倒三葉、倒五葉、倒七葉、倒九葉)中的木質素含量以及木質素合成相關基因(PAL、C3H、4CL、C4H、CAD、HCT4、COMT、F5H、CCoAOMT和CCR)的表達量，進行象草木質素含量與木質素合成相關酶基因的相關性分析，并了解木質素合成基因在葉組織與莖組織中的功能和機制上可能存在的差異，為其他木質素相關研究奠定基礎，也為今后深入地開展象草分子育種提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料取自華南農業大學草業科學系引種園中的N51象草，取樣時象草已抽穗，選取長勢相同的3株象草作為3次重復，各取莖稈倒數第一、第三、第五節間以及倒數第一、第三、第五、第七和第九葉片置于液氮中，帶回實驗室一同研磨后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗試劑

象草RNA提取采用天根植物總RNA提取試劑盒，cDNA的合成采用全式金反轉錄試劑盒，Realtime-PCR采用MonAmpTMChemoHS qPCR Mix(None ROX)試劑盒。

1.3 試驗方法

1.3.1 木質素含量的測定 將新鮮的象草樣品在60 ℃下烘干至恒質量。采用乙酰溴法測定木質素總含量，于分光光度計中測定OD280的吸光值，求得木質素的總含量，具體步驟參照王建慶等[19]的試驗方法。

1.3.2 象草木質素合成關鍵酶編碼基因的獲取 由于目前仍沒有完整可用的象草基因組和轉錄組序列，從NCBISRA(NationalCenter for Biotechnology Information Sequence Read Archive)數據庫中下載了象草轉錄組的IlluminaHiSeq 2500測序數據(SRR3952080和SRR3952081)，采用Trinity-v2.5.1(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)進行轉錄組拼接。從GenBank中獲得了水稻木質素合成關鍵酶的基因序列(表1)，通過tBlastN與拼接獲得的象草轉錄組本地Blast庫進行比對，獲得相應的象草轉錄本序列。

表1 水稻木質素合成關鍵酶的基因序列Tab.1 The gene sequence of key enzymes associated with rice lignin synthesis

1.3.3 木質素合成關鍵酶編碼基因表達量分析 采用天根植物總RNA提取試劑盒提取象草樣品RNA，反轉錄成cDNA。利用MonAmp ChemoHS qPCR Mix(None ROX)試劑盒進行實時定量PCR試驗，以獲得的象草木質素合成關鍵酶編碼基因序列為模板，利用 Primer 5.0 設計特異性實時定量PCR的引物，同時選擇持家基因ACTIN作為內參(表 2)。實時熒光定量PCR的反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40個循環。

表2 象草木質素合成關鍵酶基因實時定量PCR引物序列Tab.2 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequences for key enzyme genes of elephant grass lignin synthesis

試驗結果采用 2-ΔΔCt算法進行分析，計算出每個關鍵酶基因的相對表達量。試驗設置3次重復。

1.4 數據分析

通過Microsoft Excel 2010進行試驗結果的統計和整理并進行繪圖，運用SPSS進行方差分析、顯著性分析以及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 象草木質素的含量變化

在象草不同節間、不同葉片的木質素含量存在顯著的差異，隨著象草空間垂直結構逐漸向下，木質素的含量呈逐漸遞增的趨勢，隨著取樣葉片逐漸向下，木質素的含量也同樣呈現逐級遞增的趨勢(圖1-A)，這與象草本身莖稈與葉片的硬度變化表現出較為一致的規律，說明隨著象草的莖稈和葉片逐漸向下，木質素的合成與積累是逐漸增加的。但是將所有莖稈的木質素含量與葉片的木質素含量進行對比發現兩者間不存在顯著性差異(圖1-B)。

2.2 象草轉錄組拼接和木質素合成基因的獲取

通過Trinity對SRR3952080和SRR3952081測序數據進行denovo拼接，獲得474 330條Contigs，共計265 490 867 bp，N50為1 048 bp，GC含量為53.66%。通過tBlastN將水稻木質素合成關鍵酶的氨基酸序列與象草轉錄組Contigs進行比對檢索，選取每一種酶的最佳匹配序列，每條檢索結果的E值都極低，表明檢索匹配度非常高；對這些象草轉錄本序列進行ORF預測和翻譯，并通過InterProScan將蛋白序列與Pfam、PANTHER和SUPERFAMILY數據庫進行比對檢索，結果表明，這些序列均包含相應關鍵酶的結構域和功能域(表3)。通過以上分析證明，tBlastN檢索得到的轉錄本序列即象草木質素合成關鍵酶的編碼基因序列，可用于實時熒光定量PCR的引物設計，檢測相應基因的表達量。

A.N51象草莖稈不同節間和不同葉片中木質素含量；B.N51象草莖稈和葉片木質素含量箱型圖；不同小寫字母表示差異顯著P<0.05。圖2-3同。

2.3 象草木質素合成相關酶基因表達量分析

運用實時熒光定量PCR技術對象草的不同節間和不同葉片的木質素合成基因的相對表達量進行分析，結果顯示(圖2)，各基因在象草不同組織中均有表達，但是每個基因的表達模式各不相同。CAD在倒五節間中表達量最高，約是倒一節間的5倍，且在葉中的表達量較低；同樣的PAL在倒五節間中表達量最高，約是倒一節間的4倍，其在倒三葉片的表達量次之；CCoAOMT在倒一葉中的表達量是倒一節間的15倍；HCT4整體表達量不高；4CL在象草莖和葉中的表達量呈現遞增趨勢，其在倒九葉的表達量，均為倒一節間表達量的14倍；F5H表達量在莖中表達量較低并呈遞增趨勢，在葉片中的表達量先升高再下降，在倒七葉的表達量最高，約為倒九葉片的2倍；CCR和C4H在莖稈節間中的表達量都不高，其中倒三節間的表達量最低，隨著葉片逐漸向下，CCR在葉片中的表達量逐級遞減，C4H在倒三葉表達量最高，隨后降低，COMT在莖中的表達量顯著高于葉片，在倒五節間的表達量最高，約是葉片中表達量的6倍。

2.4 象草木質素合成相關酶基因在莖稈和葉片中的表達量比較

PAL、CAD、CCR、CCoAOMT和C4H基因在莖稈和葉片中的相對表達量無顯著性差異，4CL和F5H在葉片中的表達量顯著高于莖稈中的表達量，COMT、C3H和HCT4在葉片中的表達量顯著低于莖稈中的表達量(圖3)。這些結果說明，不同的木質素合成基因在象草不同組織中的表達豐度是不一樣的，從而導致不同組織中木質素含量和構成的差異。

表3 象草木質素合成關鍵基因的tBlastN比對和結構域及功能域檢索Tab.3 tBlastN alignment and domain search for key genes in elephant grass lignin synthesis

2.5 象草木質素含量與木質素合成相關酶基因的相關性分析

運用SPSS軟件對象草的莖和葉中的木質素含量和在其對應部位的木質素相關酶基因的表達量進行分析，結果如表4所示，在象草的莖稈中，HCT4和CCoAOMT的相對表達量與木質素含量呈現顯著正相關，F5H的相對表達量與木質素含量呈現極顯著正相關，C3H的相對表達量與木質素含量呈現極顯著負相關。在象草的葉片中，C4H、COMT和CCR的相對表達量與木質素含量呈顯著負相關，HCT4的相對表達量與木質素含量呈現極顯著負相關，4CL的相對表達量與木質素含量呈現極顯著正相關。

圖2 N51象草木質素合成相關酶基因表達量Fig.2 Expression level of N51 elephant grass lignin synthesis related enzyme gene

莖稈的表達量為所有節間表達量的平均值；葉片的表達量為所有葉片表達量的平均值。The expression level of stems is the average of all internode expression levels；The expression level of leaves is the average of all leaf expression levels.

表4 象草的莖和葉中的木質素含量與其合成相關酶的相對表達量之間的相關性Tab.4 Correlation between lignin content in elephant grass stems and leaves and relative expression of their synthetic enzymes

3 結論與討論

3.1 象草木質素合成基因表達模式的組織特異性

盡管N51象草葉組織和莖組織的木質素總含量并沒有顯著性差異，但是不同木質素合成基因的表達卻表現出了顯著的組織特異性。葉組織的COMT、C3H和HCT4基因表達量顯著低于莖組織，而4CL和F5H基因卻顯著高于莖組織。關聯分析結果表明，莖稈中的木質素含量與F5H、HCT4以及CCoAOMT基因的表達呈正相關，與C3H基因的表達呈負相關，而葉片中的木質素含量與4CL基因的表達呈正相關，與C4H、COMT、HCT4以及CCR基因的表達呈負相關。在陳博雯等[20]研究中發現抑制CCoAOMT的表達可以顯著降低G型木質素的合成效果；張婷[21]在研究酶基因4CL和CCoAOMT反義轉化紫穗槐的試驗中發現獲得的轉基因植株不僅可以正常生長，而且木質素的含量降低；師竹娟[22]在研究甘藍型油菜木質素單體合成的基因調控中，為了提高甘藍型油菜中G型木質素含量從而增強植物的抗倒伏能力，克隆了F5H基因，獲得F5H反義表達轉基因植株，發現莖稈木質素的沉淀分布發生了變化。其實目前大多數的研究都關注于木質素合成關鍵基因表達量對植株莖稈木質素含量之間的影響，鮮有關于影響葉片中木質素含量和構成的研究報道。借鑒以上的研究，注意到木質素的合成中不同的酶基因的表達量可能與合成的哪種木質素單體有關，于是本研究測定了象草不同部位的木質素含量及相關合成基因的表達量變化，結果表明，不同木質素合成基因在象草莖稈和葉片中的表達模式和作用機制都不甚相同。象草是非常重要的禾本科牧草，其葉片是牛羊食用的主要部位，葉片的木質素含量和構成能影響其適口性和營養價值，而本研究結果表明，木質素合成基因在葉組織中的功能和機制可能與莖組織存在差異，具有進一步研究的空間和價值。

3.2 G型和S型木質素單體合成關鍵基因的表達特性

植物細胞壁木質素含有H、G和S等3種類型的單體，其中G和S型單體的占比較高，因此木質素含量和成分的調控主要針對G型和S型單體的合成來進行操作。F5H(Ferulate 5-hydroxylase)將阿魏酸羥基化為5-羥基阿魏酸，5-羥基阿魏酸是合成S型木質素單體的前體。F5H編碼基因的表達變化能顯著影響被子植物中S∶G型木質素單體的比例。當敲除F5H基因時，植物只產生G型單體[23]；當F5H基因過表達時，植物體內會大量積累S型單體，其含量可高達98%[24-25]。在N51象草中，葉片F5H基因表達量顯著高于莖稈。F5H是合成S型單體的關鍵酶，葉片中F5H基因的高表達很可能意味著在葉片中S型單體的合成比莖組織更加旺盛。雖然莖稈中F5H基因的表達遠低于葉片，但是其木質素含量與F5H基因的表達量呈極顯著正相關，表明隨著莖稈的成熟和木質素的積累，F5H基因的表達會不斷上調，促進S型單體的合成。

COMT和4CL是S型和G型木質素單體合成通路中的關鍵酶，當COMT和4CL基因表達下調時，植物中的木質素總量和S/G型單體比例均會下降。當水稻中4CL基因被沉默時，植株的木質素總含量顯著降低。通過RNA干涉技術下調雜交白楊(Populustremula×Populusalba)中4CL基因的表達，能夠使雜交楊枝條的木質素單體含量顯著降低，減幅最高可達50%，S/G型單體比例下降，H型單體含量升高[26]。通過RNA干涉技術下調多年生黑麥草中(Loliumperenne)COMT1基因的表達，能夠顯著影響木質素的含量和構成，但不會對多年生黑麥草的植株健康和生物量產生負面影響，當COMT1基因的表達被顯著下調時，多年生黑麥草莖中S型和G型單體含量都顯著降低，S型單體下降幅度更大，從而導致S/G單體比例顯著下降，而H型單體的含量則沒有發生顯著性變化[27]。在象草葉片中4CL基因的表達顯著高于莖稈，且與木質素含量呈正相關，其表達量隨著葉片的成熟和木質素的積累而逐漸上調，而COMT基因的表達卻顯著低于莖稈，且與木質素含量呈顯著負相關，其表達量隨著葉片的成熟和木質素的積累而逐漸下調，這表明4CL和COMT雖然同時參與S型和G型單體的合成，但是在葉片和莖稈木質素合成中的作用機制卻不盡相同，葉片的成熟和木質素積累更依賴于4CL的作用，而莖稈則更依賴于COMT的作用。

3.3 H型木質素單體合成關鍵基因的表達特性

H型單體在木質素單體總量中占比不高，且主要在次生壁開始加厚的初期積累。H型木質素單體的合成與C3H和HCT基因密切相關[28-29]。在紫花苜蓿(Medicagosativa)中表達HCT反義載體，導致木質素含量顯著降低，并顯著改變了木質素構成，H型單體的比例會大幅度的提高。擬南芥c3h突變體表現出明顯矮化特征，推測可能是因為H型木質素含量過低，不足以滿足植物細胞壁合成所需[30]。在N51象草中，莖稈中的C3H和HCT4基因表達量均顯著高于葉片，推測高表達的C3H和HCT4基因能促進莖稈中H型單體的合成，幫助莖稈形成厚實堅硬的次生壁，從而為整棵植株提供支撐作用。

3.4 結論

木質素合成是一個非常復雜的過程，參與調控的酶有多種，分別控制3個木質素單體的合成。本研究中，測定成熟象草的不同莖稈和葉片的木質素含量，在莖稈中，隨著象草空間垂直結構逐漸向下，木質素含量逐漸增加，同樣，在葉片中，隨著象草空間垂直結構逐漸向下，木質素的含量也逐漸增加，這表明，在象草的空間垂直結構上，木質素含量在各組織中呈現逐級遞增趨勢，這與象草本身木質素的變化情況一致。測定了10種合成酶基因的表達量，并分析10種酶基因分別在莖稈和葉片中表達量對比結果，發現不同的木質素合成酶在不同的組織中呈現表達差異。這說明在不同組織中，合成的主要木質素不同。綜上所述，象草木質素的合成受到多種酶基因的調控，在不同的組織中，木質素單體含量不同。