水稻NAL11基因?qū)γ缙诜巧锬婢车捻憫?yīng)分析

王長(zhǎng)龍，張 力，羅立新，王 慧，郭 濤，劉永柱，周繼勇，陳志強(qiáng)，肖武名

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，廣東 廣州 510520)

水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物之一，在大田生產(chǎn)中經(jīng)常遭受各種非生物脅迫的影響，挖掘耐逆基因具有一定的研究意義。非生物逆境脅迫一般情況下包括干旱、高鹽、低氧、極端溫度，通常會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)一系列的生理生化和分子變化，主要是通過(guò)改變蛋白質(zhì)的功能進(jìn)而對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，對(duì)植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)均產(chǎn)生不利影響，因此保持蛋白質(zhì)的正常功能構(gòu)象對(duì)于在應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活至為重要[1-2]。

熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一類(lèi)在逆境脅迫下特別是高溫誘導(dǎo)下在生物體內(nèi)迅速合成的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)與靶蛋白結(jié)合的形式來(lái)修復(fù)已經(jīng)變性的蛋白質(zhì)，在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、維持細(xì)胞正常生理代謝功能和提高抗逆性方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。因此，熱激蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程中起著重要作用。熱激蛋白在各種生物體內(nèi)均廣泛存在[6]，根據(jù)HSPs分子量的大小，可分為5類(lèi)：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPs(Small heat shock proteins，分子量約15～50 ku，主要包含HSP20和HSP40)[7-8]。熱激蛋白可以作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊，Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)HSP21作為分子伴侶蛋白通過(guò)與光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)核心亞基蛋白(D1和D2等)的直接結(jié)合，維持高溫脅迫下PSⅡ復(fù)合體及類(lèi)囊體膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高植物高溫脅迫下光合效率及存活率。Zou等[10]研究表明，熱激蛋白對(duì)不同逆境的響應(yīng)具有多樣性，在不同逆境條件下可能存在不同調(diào)控模式。Lin等[11]研究表明，熱處理的水稻幼苗存在HAS32/HSP101轉(zhuǎn)錄后互作，從而延長(zhǎng)熱鍛煉的效應(yīng)。在擬南芥中，異源過(guò)表達(dá)OsHSP1會(huì)增加擬南芥耐熱性，熱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)率比對(duì)照更高；OsHSP1過(guò)表達(dá)植株對(duì)鹽和滲透脅迫更敏感[12]。OsHSP18.0-CI編碼一個(gè)小分子熱休克蛋白，OsHsp18.0-CI過(guò)表達(dá)株系對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性增強(qiáng)，抑制株系的抗性下降[13]。王瑩[14]研究了鹽脅迫對(duì)鹽敏感水稻品種武運(yùn)粳8號(hào)根尖細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)mtHSP70可能通過(guò)影響呼吸鏈復(fù)合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，熱激蛋白在植物應(yīng)對(duì)逆境響應(yīng)方面具有重要作用。

雖然對(duì)熱激蛋白的研究已經(jīng)開(kāi)展了幾十年，但是對(duì)于熱激蛋白與植物抗逆的認(rèn)識(shí)仍然處于初步階段[15]，對(duì)于其內(nèi)在的發(fā)生機(jī)制和分子機(jī)理方面的深入研究仍十分欠缺。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心通過(guò)圖位克隆鑒定到一個(gè)影響水稻葉寬、分蘗等株型性狀的基因NAL11，在線(xiàn)預(yù)測(cè)其編碼產(chǎn)物為一個(gè)Hsp40家族的熱激蛋白[16]。根據(jù)已有報(bào)道，熱激蛋白在植物應(yīng)對(duì)逆境響應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用，NAL11基因是否也參與了植物逆境，闡明該基因在逆境方面的作用，有助于全面了解其功能。本研究用攜帶NAL11基因的粳型水稻品種02428及其近等基因系材料NIL-8(攜帶突變了的nal11基因)進(jìn)行苗期逆境方面的研究，通過(guò)表型比較、生理指標(biāo)測(cè)定及基因表達(dá)分析明確NAL11基因?qū)τ诓煌婢趁{迫的響應(yīng)，擬探明其參與的逆境調(diào)控情況。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究所用的水稻材料為粳型水稻品種02428(攜帶NAL11基因)及BC4F6近等基因系NIL-8(以02428作輪回親本培育而成，攜帶隱性基因nal11[16])，經(jīng)56 K基因組芯片分析發(fā)現(xiàn)NIL-8與02428的遺傳背景一致性高達(dá)98.75%。將02428與NIL-8催芽萌發(fā)后均在相同的人工氣候箱中育苗，其中溫度脅迫用稻田土育苗，干旱和鹽脅迫采用國(guó)際水稻研究所水培營(yíng)養(yǎng)液[17]培育幼苗，14 d后對(duì)02428與NIL-8的幼苗進(jìn)行脅迫處理。為了較好地開(kāi)展脅迫處理，前期采用不同的溫度梯度、鹽濃度梯度及15% PEG-6000的濃度梯度開(kāi)展了預(yù)處理試驗(yàn)。最后確定本研究的高溫脅迫處理為42 ℃，持續(xù)3 d；低溫脅迫處理為10 ℃，持續(xù)5 d；鹽脅迫為100 mmol/L NaCl的水培液處理3 d；模擬干旱脅迫采用15% PEG-6000的水培液處理3 d；均在上海啟前電子科技有限公司生產(chǎn)的二氧化碳人工氣候箱(貨號(hào)PRX-600C-CO2)中種植，光照12 h(光照強(qiáng)度為12 000 lx)、黑暗12 h。在處理的不同時(shí)間點(diǎn)取水稻葉片測(cè)定SPAD(Soil and plant analyzer develotrnent)、相對(duì)電導(dǎo)率、含水量、可溶性蛋白、CAT(Catalase)、SOD(Superoxide dismutase)等生理指標(biāo)。

1.2 相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定

葉綠素測(cè)定：隨機(jī)選取5株相對(duì)一致的幼苗標(biāo)記后取完全展開(kāi)的第二葉，利用點(diǎn)將(上海)科技股份有限公司生產(chǎn)的葉綠素測(cè)定儀(貨號(hào)SPAD-502)進(jìn)行測(cè)定。

葉片含水量測(cè)定：將葉片從葉基部剪下，稱(chēng)量鮮質(zhì)量，隨后用錫箔紙包裹放入105 ℃殺青1 h，在80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱(chēng)取干質(zhì)量，計(jì)算各葉片樣本含水量=(葉片鮮質(zhì)量-葉片干質(zhì)量)/葉片鮮質(zhì)量×100%[18]。

相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定：將水稻葉片剪成1 cm長(zhǎng)的碎片樣品，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g樣品，對(duì)應(yīng)放入已編號(hào)的三角瓶中，加入10 ml無(wú)離子水在振蕩器上浸泡90 min。采用上海恒磁電子科技有限公司生產(chǎn)的電導(dǎo)儀(型號(hào)為DDS-11A型)測(cè)定初始電導(dǎo)率R1，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測(cè)定浸提液的電導(dǎo)率R2。根據(jù)公式Ec=R1/R2×100%計(jì)算細(xì)胞傷害率，其中R1為煮沸前的初始電導(dǎo)率、R2為煮沸冷卻后的電導(dǎo)率[19]，3次生物學(xué)重復(fù)。

可溶性蛋白含量測(cè)定：取幼苗根上部分進(jìn)行勻漿，采用生工BCA法微量蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Micro BCA Protein Assay Kit，貨號(hào)C503061)進(jìn)行測(cè)定，3次生物學(xué)重復(fù)。

SOD和CAT測(cè)定：取水稻葉片部分進(jìn)行勻漿，分別采用南京建成生物科技有限公司SOD測(cè)定試盒(貨號(hào)A001-1)和CAT測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A007-1)進(jìn)行測(cè)定，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 基因NAL11在不同逆境處理下的表達(dá)量分析

對(duì)02428在各種逆境處理下的不同時(shí)間點(diǎn)取樣，非處理的幼苗作為平行對(duì)照。分別采用GENEMARK試劑盒(貨號(hào)TR02)及TOYOBO公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)FSK-100)提取總RNA并合成cDNA。在美國(guó)ABI公司StepOne定量PCR儀開(kāi)展實(shí)時(shí)定量PCR分析，所用試劑為VAZYME公司的試劑(貨號(hào)SYBR Green Master Mix Q111-02)。水稻β-Actin基因(LOC_Os03g50885)作為內(nèi)參。定量PCR分析的引物(5′-3′)分別為Actin-F：TCTCTCAGCACATTCCAGCA、Actin-R：AATCACAAGTGAGAACCACAG；NAL11-F：CTACACCACTCATAGCAGGACTCAC、NAL11-R：GAAAGCCACCTTCATAGAATTTGCG。定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL(10 μL的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，正反引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2 μL的模板，7.2 μL的ddH2O)，采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)程序(擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃反應(yīng)10 s，60 ℃反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán))；最后按照2-ΔΔCT法[20]分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量及其標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016和Prism 7對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每處理取5株進(jìn)行分析、3次生物學(xué)重復(fù)，采用SPASS 19.0開(kāi)展方差分析和t測(cè)試，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤用于數(shù)據(jù)展示和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫處理對(duì)水稻02428及NIL-8幼苗的影響

由圖1可知，42 ℃高溫處理3 d后，02428和NIL-8的葉片均表現(xiàn)出一定的黃化，但二者無(wú)明顯差異；經(jīng)100 mmol/L NaCl處理3 d，二者均出現(xiàn)不同程度的萎蔫，但無(wú)明顯差異；10 ℃處理5 d后，02428及NIL-8葉片均呈現(xiàn)明顯的卷曲且葉尖干枯，常溫恢復(fù)培養(yǎng)7 d后所有幼苗全部枯死，二者無(wú)明顯差異；15% PEG-6000模擬干旱處理下，02428及NIL-8均出現(xiàn)明顯的葉片卷曲、葉尖萎蔫等癥狀，但02428萎蔫程度更嚴(yán)重，推測(cè)NIL-8的抗旱能力可能優(yōu)于02428。

2.2 脅迫處理對(duì)葉綠素含量的影響

葉綠素含量即SPAD值，與光合速率、作物營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)。一般情況下通過(guò)測(cè)定葉綠素含量以表征作物生長(zhǎng)狀況。在不同脅迫處理期間，02428與NIL-8的葉片SPAD值均有所下降(圖2)，說(shuō)明高溫、低溫、鹽害及模擬干旱均對(duì)植株的葉綠素合成造成了影響。高溫脅迫下，兩者葉片SPAD值在0～48 h均在下降，在48 h后下降幅度明顯加快，且在72 h表現(xiàn)出顯著差異(圖2-A)；低溫和鹽害脅迫下，02428和NIL-8的SPAD值均緩慢下降，兩者下降趨勢(shì)基本相同，兩者的SPAD值也無(wú)顯著差異(圖2-B、C)；15% PEG-6000處理下，兩者的SPAD值均下降較快，但在處理12 h以后，NIL-8的SPAD的含量始終高于02428，且差異達(dá)顯著水平(圖2-D)，說(shuō)明模擬干旱脅迫對(duì)NIL-8葉綠素合成的影響較小，與其模擬干旱下的葉片萎蔫程度基本吻合。

2.3 脅迫處理對(duì)葉片含水量的影響

與對(duì)照相比，02428和NIL-8的葉片含水量在4種逆境脅理下均呈下降趨勢(shì)(表1)。42 ℃高溫處理3 d時(shí)，02428的葉片含水量從81.07%降低至74.64%，下降了6.43百分點(diǎn)，NIL-8的葉片含水量從80.93%降低至74.38%，下降了6.55百分點(diǎn)，兩者下降幅度差異不顯著。10 ℃低溫處理3 d時(shí)，02428的葉片含水量從81.07%降低至65.55%，下降了15.52百分點(diǎn)，NIL-8的葉片含水量則從80.93%降低至65.11%，下降了15.82百分點(diǎn)，兩者下降幅度差異也不顯著。100 mmol/L NaCl處理3 d時(shí)，02428的葉片含水量從80.78%降低至64.39%，下降了16.39百分點(diǎn)，NIL-8的含水量則從79.83%降低至72.25%，下降了7.58百分點(diǎn)，下降幅度低于02428，且處理后NIL-8的葉片含水量仍顯著高于02428。15% PEG-6000處理3 d時(shí)，02428的葉片含水量從80.78%降低至70.17%，下降了10.61百分點(diǎn)，NIL-8的含水量則從79.83%降低至72.41%，下降了7.42百分點(diǎn)，下降幅度低于02428。由此可知，在高溫和低溫處理下，02428與NIL-8含水量下降幅度基本相當(dāng)，而在鹽處理和模擬干旱處理下NIL-8的葉片含水量下降幅度均小于02428，說(shuō)明NIL-8在處理后仍能保持相對(duì)較高的葉片含水量。

同一張圖片的左邊植株為02428，右邊植株為NIL-8；標(biāo)尺為2 cm。The plants in the left side of the same picture are 02428，and the plants in the right side are NIL-8； Scale bar = 2 cm.

不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)。圖3-4同。Different small letters indicates significant difference among treatments at 0.05 level.The same as Fig.3-4.

表1 不同脅迫處理下02428和NIL-8的葉片含水量Tab.1 The water content in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments %

2.4 脅迫處理對(duì)葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

葉片相對(duì)電導(dǎo)率也被稱(chēng)為細(xì)胞膜相對(duì)透性，在一定情況下能夠反映出植物的受傷害程度。隨著逆境處理的進(jìn)行，葉片相對(duì)電導(dǎo)率逐漸增大，說(shuō)明逆境對(duì)苗期植株均造成了損傷，并隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而加重(圖3)。42 ℃高溫條件下，在處理48，72 h，02428的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于NIL-8(圖3-A)，說(shuō)明NIL-8葉片細(xì)胞液外滲程度較小，高溫對(duì)其傷害較低。在低溫處理24，48 h，02428的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于NIL-8，但處理到72 h兩者的相對(duì)電導(dǎo)率并無(wú)顯著差異(圖3-B)，說(shuō)明在低溫處理前期02428所受傷害程度小于NIL-8。100 mmol/L NaCl處理下，02428與NIL-8的相對(duì)電導(dǎo)率在24 h顯著高于0 h，但在48 h兩者的相對(duì)電導(dǎo)率與24 h的變化不顯著，而到72 h兩者的相對(duì)電導(dǎo)率均上升到一個(gè)新的水平(圖3-C)，說(shuō)明在鹽脅迫處理前期可能對(duì)植株傷害較大，處理過(guò)程中植株可能存在相應(yīng)的應(yīng)對(duì)機(jī)制來(lái)抑制細(xì)胞液的滲透，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，這種應(yīng)對(duì)機(jī)制被打破，相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)一步升高。在整個(gè)鹽脅迫處理下，02428與NIL-8的相對(duì)電導(dǎo)率均無(wú)顯著差異。15% PEG-6000的模擬干旱處理后02428的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于NIL-8(圖3-D)，說(shuō)明在幼苗期NIL-8的抗旱能力優(yōu)于02428，與前述的表型以及葉綠素含量、葉片含水量的測(cè)定結(jié)果基本吻合。

圖3 不同脅迫處理下02428和NIL-8苗期葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.3 The relative conductivity in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments

2.5 脅迫處理對(duì)葉片SOD與CAT活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是一種能夠清除活性氧的保護(hù)酶，因此SOD活性的變化能夠反映逆境脅迫的生理指標(biāo)。高溫、低溫、鹽脅迫處理3 d時(shí)，02428與NIL-8葉片中SOD活性與對(duì)照相比均有所降低，但均無(wú)顯著差異；而模擬干旱處理下，02428與NIL-8葉片SOD活性與對(duì)照相比均有所升高，但仍未達(dá)到顯著水平，且升高后兩者差異并不顯著(表2)。總體而言，02428與NIL-8在4種脅迫處理下的SOD活性無(wú)顯著差異。

表2 不同脅迫處理下02428和NIL-8葉片的SOD活性Tab.2 The SOD activity in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments U/mg

過(guò)氧化氫酶是(CAT)是一類(lèi)重要的抗氧化酶，能有效地清除活性氧基團(tuán)，防止細(xì)胞膜氧化損傷。42 ℃高溫處理后02428與NIL-8的CAT活性均比其對(duì)照顯著下降，而NIL-8的降幅更大(表3)。10 ℃低溫處理后，02428的CAT活性有所降低，與其對(duì)照相比并無(wú)顯著差異；但NIL-8的CAT活性不但顯著高于其對(duì)照，也顯著高于處理后的02428。100 mmol/L NaCl處理后，02428與NIL-8的CAT活性比其對(duì)照均顯著增加，且02428顯著高于NIL-8。15% PEG-6000處理后，02428的CAT活性比其對(duì)照增加，但未達(dá)顯著水平；而NIL-8的CAT活性顯著高于其對(duì)照和處理后的02428(表3)。由此可見(jiàn)，不同脅迫處理下，兩者的CAT活性呈現(xiàn)出明顯不同的變化，高溫脅迫導(dǎo)致CAT活性的明顯下降，而鹽脅迫處理則導(dǎo)致CAT活性的明顯升高。

2.6 NAL11受不同逆境脅迫誘導(dǎo)

在高溫處理的4，8，36，72 h時(shí)，NAL11的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(圖4-A)。說(shuō)明在02428中NAL11的表達(dá)受高溫的正向誘導(dǎo)。低溫處理時(shí)，NAL11在24 h時(shí)表達(dá)量顯著低于對(duì)照，而在6，72 h表達(dá)量顯著高于對(duì)照(圖4-B)。在100 mmol/L NaCl處理的4，8 h，NAL11的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(圖4-C)，說(shuō)明NAL11的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)受鹽脅迫的正向誘導(dǎo)，但在24 h時(shí)則相反。在15% PEG-6000模擬干旱處理的4，6 h時(shí)，NAL11的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，在8 h則顯著低于對(duì)照(圖4-D)。可見(jiàn)，在不同逆境處理下，NAL11的表達(dá)量在較短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速升高，隨后隨著逆境處理的持續(xù)，NAL11的表達(dá)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的變化，說(shuō)明不同的逆境處理均可以快速誘導(dǎo)基因NAL11的表達(dá)。

表3 不同脅迫處理下02428和NIL-8葉片的CAT活性Tab.3 The CAT activity in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments U/mg

圖4 不同逆境處理時(shí)02428中基因NAL11的表達(dá)動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic expression of NAL11 in 02428 under treatments of different stress

3 結(jié)論與討論

熱激蛋白廣泛存在于各種生物中，能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫[21]。研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白基因OsHsp18.0-CI能夠受到白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)OsHsp18.0-CI的轉(zhuǎn)基因水稻增強(qiáng)了對(duì)多個(gè)白葉枯病致病菌株的抗性[13]。OsHsp18.0過(guò)表達(dá)和沉默系分別對(duì)熱處理和鹽處理表現(xiàn)出增強(qiáng)和降低的耐受性[22-23]。許錦彪等[24]利用熒光定量PCR技術(shù)研究了一個(gè)編碼DnaJ結(jié)構(gòu)域的熱激蛋白基因Os07g0620200在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，高溫、干旱、鹽處理以及外源精胺的處理均促進(jìn)了該基因的表達(dá)；該基因在黃華占中的表達(dá)量始終高于雙桂1號(hào)，表明黃華占在逆境條件下具有更好的耐受性。通常情況下，熱激和其他逆境條件下會(huì)影響熱激蛋白基因的表達(dá)，但是這種表達(dá)模式并不是單一的。本研究中，基因NAL11的表達(dá)量在高溫、低溫、鹽及模擬干旱脅迫處理的短時(shí)間內(nèi)迅速升高，尤其在高溫和鹽處理4 h時(shí)及低溫處理6 h時(shí)，02428中NAL11的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，該結(jié)果反映了該基因在受到逆境脅迫時(shí)迅速響應(yīng)的特點(diǎn)。但是隨著不同脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，NAL11的表達(dá)模式發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。在高溫處理下，NAL11的表達(dá)量始終高于對(duì)照，在處理72 h時(shí)其表達(dá)量已經(jīng)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明在水稻苗期NAL11受高溫的持續(xù)正向誘導(dǎo)。而在低溫和模擬干旱脅迫下，NAL11的表達(dá)趨勢(shì)較為復(fù)雜。在本研究中，基因NAL11在不同的脅迫以及在同一脅迫的不同時(shí)期呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，原因可能是由于NAL11在生育期內(nèi)本身會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化影響其表達(dá)水平。

逆境脅迫能夠影響植物相關(guān)的生理代謝過(guò)程，因此可以通過(guò)相關(guān)生理指標(biāo)來(lái)反映逆境對(duì)植物的傷害程度及其抗逆能力。在逆境脅迫下，綠色植物葉綠素合成降低，光合作用減弱[25]。在本研究中，02428與NIL-8苗期葉片的SPAD隨著不同逆境處理時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸下降，說(shuō)明逆境影響了兩者苗期的葉綠素合成，且對(duì)植物造成了不同程度的傷害。尤其是在模擬干旱下，02428的SPAD下降幅度高于NIL-8，說(shuō)明NIL-8在干旱脅迫下仍能保持較高的葉綠素含量。盡管4種脅迫處理使兩者的葉片含水量均降低，但在鹽脅迫和模擬干旱脅迫下NIL-8相比02428能維持更高的葉片含水量。相對(duì)電導(dǎo)率能夠反映逆境脅迫下細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏的情況，因此，可作為反映植物抗逆強(qiáng)弱的一個(gè)指標(biāo)[26-27]。在本研究中，4 種脅迫處理下的水稻葉片電導(dǎo)率均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，說(shuō)明了細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏逐漸加大，細(xì)胞膜的傷害隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。但是在高溫和模擬干旱條件下，無(wú)論是在48 h、還是72 h，02428的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于NIL-8，說(shuō)明NIL-8在高溫和干旱脅迫下仍能維持較低的電解質(zhì)滲漏水平，其耐高溫和耐旱能力可能優(yōu)于02428。

水稻在遭受逆境脅迫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧代謝平衡失調(diào)而產(chǎn)生活性氧對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷[28]。而超氧化物歧化酶(SOD)與過(guò)氧化氫酶(CAT)作為2種最有效的抗氧化酶，能夠減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害[29]。郭培國(guó)等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理水稻2～3 d會(huì)引起植株體內(nèi)SOD和CAT活性增加，但是時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶活性降低從而對(duì)植株產(chǎn)生過(guò)氧化作用。施大偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，雜交水稻幼苗體內(nèi)SOD活性逐漸升高，而POD、CAT活性逐漸下降。馬廷臣等[32]利用PEG-6000模擬干旱處理，對(duì)不同耐旱品種苗期根系酶類(lèi)活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗旱能力強(qiáng)的品種較抗旱性弱的品種，其SOD活性、POD活性均增加。在本研究中，不同的脅迫處理并未導(dǎo)致兩者SOD酶活性的顯著差異，說(shuō)明基因NAL11可能并不影響SOD活性。02428與NIL-8的CAT活性在高溫處理下均顯著下降，說(shuō)明高溫嚴(yán)重抑制兩者體內(nèi)CAT的產(chǎn)生，過(guò)氧化氫的清除能力受到影響，植株均受到一定程度的傷害，與高溫下兩者均表現(xiàn)出一定程度的黃化表型基本吻合。相反地，鹽脅迫和模擬干旱脅迫均使兩者的CAT活性提高，但在鹽脅迫下02428顯著高于NIL-8，在模擬干旱脅迫下NIL-8卻顯著高于02428。不同的脅迫處理導(dǎo)致兩者的CAT活性也有所不同，說(shuō)明基因NAL11可能通過(guò)影響CAT活性在不同脅迫中發(fā)揮作用。可見(jiàn)，02428與NIL-8在4種不同脅迫下表現(xiàn)出了表型及生理指標(biāo)上的差異，可能與基因NAL11的表達(dá)差異有關(guān)。

總體而言，在干旱脅迫下，NIL-8能保持較輕的萎蔫程度、較高的葉綠素含量、較高的葉片含水量、較低的電解質(zhì)滲漏水平、較高的CAT活性，說(shuō)明NIL-8可能具有更好的耐旱性，推測(cè)NAL11可能作為一種負(fù)調(diào)控基因參與了水稻幼苗的耐旱性，具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。