類烏齊牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因克隆與組織表達分析

鐘 美，王吉坤，柴志欣，王 會，王嘉博，武志娟，信金偉，張成福，姬秋梅，鐘金城

(1.西南民族大學 青藏高原研究院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850000)

牦牛(Bosgrunniens) 耐粗耐勞，具有極強的生態環境適應性，在氧氣稀薄、天氣寒冷、牧草匱乏等惡劣環境條件下均可生存、繁衍后代，是極為寶貴的遺傳資源基因庫[1-3]。類烏齊牦牛主要生存于海拔3 700 m以上的高原，因其遺傳多樣性豐富，肉質鮮美，在2017年通過了國家畜禽資源委員會審定，評為優良的牦牛遺傳資源[4]。

補體C1q(Complement 1)分子是由6個亞單位組成的異源六聚體，每個亞單位分別由C1QA、C1QB、C1QC基因編碼的A、B、C 3條多肽鏈組成，即C1q 由18條多肽鏈構成[5]。鏈間靠3條鏈的N端半胱氨酸形成二硫鍵相連，構成同一個亞單位中的A-B 二聚體以及2個亞單位間的C-C二聚體，因此組成6個A-B二聚體和3個C-C二聚體。兩A-B二聚體和一個C-C二聚體以非共價鍵形成含有2A、2B和2C的結構單位，3個這樣的結構單位憑借非共價鍵構成完整的 C1q 分子[6]。補體系統是由存在于動物血清和組織液中的一組可溶性蛋白以及存在于其他細胞表面的一組膜結合蛋白和補體受體組成的，是一個復雜的蛋白質反應系統，在機體的抗感染免疫防御、維護內環境穩定、氧化應激、糖脂代謝中發揮重要作用。C1q是分子量為460 ku的糖蛋白，是C1的第一組成成分，對病原體的清除和細胞凋亡等重要生物過程至關重要[7]，同時是啟動補體系統經典途徑的重要識別分子，在天然免疫和特異性免疫之間發揮連接作用[8]。

目前，C1QA、C1QB、C1QC基因在人[9]、牛[10]、豬[11]、鼠[12]等哺乳動物中均已得到廣泛研究，多與疾病相關，在綿羊各個組織中也均有表達[13]，該基因在牦牛中的研究鮮有報道。補體C1q蛋白與系統性紅斑狼瘡、免疫性腎病等免疫疾病[14]和缺氧條件下血管生成、促進缺血心肌新生血管形成等低氧適應有關[15-16]。如在Tohgi等[17]研究中發現小鼠PC12細胞在缺氧后立即表達C1q mRNA，然后在復氧過程中翻譯出C1q蛋白的A、B、C鏈，導致缺氧細胞受損。Luo等[18]發現缺氧后C1q沉積是誘導阿爾茨海默病(AD)中神經元氧化應激和神經元死亡的重要因素，進一步證實了C1q是導致缺氧細胞受損傷的重要原因。Bossi等[19]研究表明，C1q與糖尿病患者慢性皮膚潰瘍創面愈合及缺氧條件下腦損傷的血管生成有關。Fan等[20]研究結果顯示，C1q可促進血管內皮生長因子VEGF的表達和分泌，通過LAIR-HIF1α-VEGF軸(重組人白細胞相關免疫球蛋白樣受體1-缺氧誘導因子α-血管內皮生長因子)增強大腦動脈閉塞大鼠的血管新生以減輕腦水腫，由此可知，在缺氧狀態下C1q確實能促進血管的生成。在維持機體的免疫耐受[21]方面，C1q 可識別許多自身結構發生改變的配體，如β淀粉樣蛋白纖維[22]、凋亡細胞[23]、低密度脂蛋白修飾形式[24]和朊病毒蛋白病理形式[25]，C1q 分子與這些配體結合可快速啟動細胞的吞噬作用，從而清除凋亡細胞，抑制溶解效應和炎癥。另一方面毋文靜[26]研究發現CTRP6(一種脂肪分泌因子，屬于補體C1q相關蛋白家族)通過Erk1/2和p38MAPK信號通路可調控豬肌內和皮下脂肪細胞的分化，以及皮下脂肪細胞的增殖。

缺氧組織中由于補體C1q沉積會導致細胞病變，研究表明神經元受β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta，Aβ)[27]、谷氨酰胺[28]、機械損傷[29]、超氧化物歧化酶(SOD)變異[30]以及單純皰疹病毒感染[31]等因素刺激可產生氧化應激產物(ROS)，而補體C1q蛋白可通過細胞表面受體促進巨噬細胞的吞噬作用并刺激中性粒細胞產生ROS， ROS過量會干擾細胞的正常功能[32]。趙杰等[33]研究顯示肝臟器官中發生氧化應激時，含量過多的ROS會使細胞的抗氧化防御能力有所衰減。ROS可通過激活NF-κB、TGFβ、Nrf2等相關信號分子、細胞因子及其下游信號通路調控肝纖維化的發生和發展，如Nrf2作為調節氧化應激的重要轉錄因子，可調節肝臟中解毒和抗氧化防御相關基因的表達[34]，在氧化應激的刺激下，Nrf2磷酸化后與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelchlike ECH-associated protein 1，Keap1)解離，進入到細胞核后與抗氧化反應元件(Antioxidant response elements，ARE) 序列結合，發揮抗氧化作用[35]，所以C1q蛋白可以激活Nrf2，使得機體內源性抗氧化系統增強。

本研究以類烏齊牦牛為研究對象，通過克隆其C1QA、C1QB、C1QC基因的CDS區，并對CDS區進行生物信息學分析，預測其信號肽、親水性/疏水性、跨膜區、理化性質、蛋白質二級及三級結構，實時熒光定量分析其在不同組織中的表達情況，為更進一步探討C1QA、C1QB、C1QC基因在牦牛低氧適應性中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 采集樣本 本試驗樣本取自西藏昌都市類烏齊縣，挑選身體健康的6月齡牦牛3頭，采集脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肺臟組織，組織使用DEPC水預處理，放于液氮中保存備用。

1.1.2 主要試劑 pMDTM19-T Vector cloning Kit、YB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ，購自TaKaRa公司；DNA 純化回收試劑盒、DL-2000 Marker、大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 參照GenBank中牦牛C1QA(XM_005905182.20)、C1QB(XM_005905180.2)、C1QC(XM_005905183)基因mRNA 的預測序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物。引物(表1)由擎科生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.2.2 樣品RNA提取及檢測 將各組織樣本，利用液氮于研缽中研磨至粉末狀后移入1.5 mL無RNase離心管中，TRIzol(Invitrogen)試劑1 mL溶解，根據TRIzol法提取總RNA。使用NanoDropTMOne 2000分光光度計檢測RNA樣品的純度和濃度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.3 反轉錄 根據反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (TaKaRa)使用說明，將提取總RNA反轉錄成cDNA，于-20 ℃保存備用。

1.2.4C1QA、C1QB、C1QC基因PCR擴增 反應體系(25 μL)：cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，TaqGreen PCR Master Mix(2×)12. 5 μL。反應程序參見文獻[36]。PCR產物用1.0%凝膠電泳檢測后根據DNA純化試劑盒使用說明純化回收DNA。

1.2.5 克隆及測序 pMD19-T載體與純化后的PCR產物連接，將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，涂布于含氨芐的LB 固體培養基表面，37 ℃恒溫培養箱中倒置培養10～14 h；選取白色菌落置于液體培養基中，37 ℃/(180 r/min)搖床中培養；用菌液PCR鑒定陽性克隆，送擎科生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.6 生物信息學分析 利用在線軟件(表2)對C1QA、C1QB、C1QC蛋白進行生物信息學分析。

1.3 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

利用YB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ試劑(TaKaRa)，實時定量PCR檢測C1QA、C1QB、C1QC基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等組織的相對表達量。

反應體系 (10 μL)：YB GreenTMPremix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，無RNAase水3. 4 μL。反應程序參見文獻[36]。利用熔解曲線來鑒定引物特異性，每個樣品設置3個生物學重復，3個技術重復。以牦牛β-actin為內參基因，記錄每個樣品的Ct值，利用 2-ΔΔCt法得到各個樣本的相對表達量。

表2 在線分析軟件Tab.2 Online analysis software

利用GraphPad Prism 5繪制C1QA、C1QB、C1QC基因在類烏齊牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織中的相對表達柱狀圖，根據SPSS 22.0軟件分析得到各組織間的差異顯著性，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因克隆

牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因PCR擴增結果見圖1，分別獲得835，945，850 bp的擴增產物，與預期結果(表1)相符。

M.DL2000 DNA Marker；1-3.C1QA、C1QC、C1QB基因。M.DL2000 DNA Marker；1-3.C1QA，C1QC，C1QB genes，respectively.

2.2 同源性分析及構建系統進化樹

利用DNAMAN軟件將克隆獲得牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因CDS區與普通牛、水牛、野豬、人、卡氏小鼠和高原地山雀基因的CDS區進行比較，結果顯示，牦牛C1QA基因與普通牛(XM_001014945.2)、水牛(XM_006063784.2)、野豬(XM_001003924.1)、人(XM_001347465.2)、卡氏小鼠(XM_021160797.2)、高原地山雀(XM_065528281.2)的序列一致性分別為99.0%，95.9%，30.7%，67.3%，60.4%和28.3%；牦牛C1QB基因與普通牛(XM_001046599.2)、水牛(XM_006063788.2)、野豬(XM_001244283.1)、人(XM_001371184.1)、卡氏小鼠(XM_021160680.2)、高原地山雀(XM_005528279.2)的一致性分別為99.3%，97.2%，28.3%，34.7%，29.3%和34.2%；牦牛C1QC基因與普通牛(XM_001206396.1)、水牛(XM_025278760.1)、野豬(XM_001244286.1)、人(XM_001114101.3)、卡氏小鼠(XM_021160901.2)、高原地山雀(XM_014257216.1)的一致性分別為82.7%，84.1%，81.3%，100.0%，77.9%和63.9%。

利用ClustalX和MAGA 5.2構建類烏齊牦牛(Lwq yak)與水牛(Bubalusbubalis)、普通牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)、卡氏小鼠(Muscaroli)、野豬(Susscrofa)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、青藏高原蛙(Nanoranaparkeri)、斑馬魚(Daniorerio)和高原地山雀(Tibetan ground-tit)C1QA、C1QB、C1QC基因核苷酸序列的系統進化樹。結果(圖2-4)表明，類烏齊牦牛C1QA、C1QB基因最先與普通牛、水牛、藏羚羊聚為一類，其次是卡氏小鼠、人、黑猩猩等其他動物，而類烏齊牦牛C1QC基因卻最先與人、長尾獼猴、野豬聚為一類，其次是水牛、普通牛等其他動物，說明類烏齊牦牛C1QA、C1QB基因與普通牛親緣關系最近，類烏齊牦牛C1QC基因則與人親緣關系最近，類烏齊牦牛C1QA基因與野豬、高原地山雀親緣關系最遠，類烏齊牦牛C1QB、C1QC基因與斑馬魚親緣關系最遠。

2.3 序列分析結果

使用NCBI ORF Finder對克隆所得牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因序列進行開放閱讀框分析，可知C1QA基因開放閱讀框長735 bp，共編碼244個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；C1QB基因開放閱讀框長744 bp，共編碼247個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；C1QC基因開放閱讀框長732 bp，編碼243個氨基酸。

圖2 11個不同物種基于C1QA基因的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on C1QA gene sequences of 11 species

圖3 12個不同物種基于C1QB基因的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on C1QB gene sequences of 12 species

圖4 10個不同物種基于C1QC基因的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on C1QC gene sequences of 10 species

2.4 牦牛C1QA、C1QB、C1QC蛋白結構和功能預測

2.4.1 理化性質 根據在線軟件ExPASy Prot-Param 程序預測C1QA、C1QB、C1QC蛋白的理化性質。預測結果(表3)顯示，C1QA、C1QB和C1QC蛋白所含氨基酸殘基以甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)最多；不穩定系數分別為34.11，18.79和28.77，均屬于穩定蛋白；脂肪系數分別為66.68，72.59和67.74，總平均親水系數分別為-0.386，-0.353和-0.298，依據氨基酸分值越低親水性越強或分值越高疏水性越強的規律分析可知， C1QA、C1QB和C1QC蛋白整體表現出較強的親水性，屬親水性蛋白。

2.4.2 蛋白結構預測分析 利用軟件SignalP 5.0、TMHMM、Interpro和NetPhos 2.0在線工具分別預測C1QA、C1QB和C1QC蛋白質的信號肽、跨膜結構、蛋白結構域和磷酸化位點。結果顯示，C1QA、C1QB和C1QC蛋白均含有信號肽和C1Q結構域，不含跨膜結構域；蛋白氨基酸序列中分別存在18，21，15 個潛在的磷酸化位點，其中C1QA編碼的氨基酸含有12個Ser磷酸化位點、4個Thr磷酸化位點、2個Tyr 磷酸化位點；C1QB包含10個Ser磷酸化位點、8個Thr磷酸化位點、3個Tyr磷酸化位點；C1QC檢測到8個Ser磷酸化位點、5個Thr磷酸化位點、2個Tyr磷酸化位點。

表3 C1QA、C1QB、C1QC蛋白序列分析Tab.3 Analysis of C1QA，C1QB and C1QC genes sequences

利用ExPaSy中SOPMA、SWISS-MODEL和PSORTⅡPrediction工具預測C1QA、C1QB和C1QC蛋白的二、三級結構和亞細胞定位，結果顯示C1QA、C1QB和C1QC蛋白二級結構主要以無規則卷曲為主，比例分別為61.85%，63.97%，66.67%，其中在蛋白結構相似性比對中C1QA與5hkj.1結構具有75.71% 的相似性，C1QB、C1QC與5hkj.1結構相似性分別可達73.33% 和74.81%；三級結構由無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉角構成(圖5-7)；蛋白質的亞細胞定位預測顯示，C1QA、C1QB、C1QC位于細胞外(包括細胞壁)的比例分別為55.6%，66.7%，66.7%，C1QA與C1QB位于內質網、高爾基體各占11.1%，C1QB、C1QC位于高爾基體所分泌的囊泡中分別占11.1%和22.2%，C1QA位于細胞骨架、細胞核內各占11.1%，C1QC還有11.1%位于線粒體。

圖5 牦牛C1QA蛋白的三級結構預測Fig.5 The tertiary structure prediction of C1QA protein in Bos grunniens

圖6 牦牛C1QB蛋白的三級結構預測Fig.6 The tertiary structure prediction of C1QB protein in Bos grunniens

圖7 牦牛C1QC蛋白的三級結構預測Fig.7 The tertiary structure prediction of C1QC protein in Bos grunniens

2.4.3 功能預測 通過蛋白功能預測分析，C1QA、C1QB和C1QC蛋白的主要功能包括細胞表面受體信號通路的調控、基因表達調節、代謝過程的調節等(表4)。

表4 C1QA、C1QB、C1QC蛋白功能分析Tab.4 The functional analysis of C1QA， C1QB and C1QC protein in Bos grunniens %

2.4.4 蛋白網絡互作分析 C1QA、C1QB和C1QC蛋白是組成C1Q蛋白的3條鏈，均含有C1Q結構域，相關性較高，以C1QC蛋白為例，C1QA和C1QC的相關性為0.976，C1QB與C1QC間的相關性為0.996，補體系統第一成分的S亞成分(C1S)和C1QC的相關性可達0.910，SERPING1是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的G1成員，與C1QC的相關性為0.864，蛋白酪氨酸激酶結合蛋白(TYROBP)與C1QC間的相關性可達0.815，組織蛋白酶S(CTSS)為木瓜蛋白酶超家族成員，在抗原遞呈中起重要作用，并可水解多種蛋白，參與多種疾病的病理過程，與C1QC的相關性達到了0.805(圖8)。

圖8 C1QA、C1QB、C1QC蛋白網絡互作分析圖Fig.8 C1QA，C1QB，C1QC protein network interaction analysis

2.5 C1QA、C1QB、C1QC基因在類烏齊牦牛各組織中的差異表達分析

實時熒光定量PCR對類烏齊牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中C1QA、C1QB、C1QC基因mRNA表達水平進行檢測，用2-ΔΔCt法計算C1QA、C1QB、C1QC基因表達量，結果(圖9-11)表明：C1QA、C1QB、C1QC基因在所檢測組織中均有表達，在肺臟中C1QB基因的表達量最高，C1QA次之，C1QC基因的表達量最低，其中類烏齊牦牛C1QA、C1QB基因在脾臟、肺臟中的表達量極顯著高于心臟、肝臟和腎臟中的表達量(P<0.01)；C1QC基因在肺臟中的表達量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的表達量(P<0.01)，在心臟中的表達量極顯著低于脾臟和肝臟(P<0.01)，顯著高于腎臟(P<0.05)；C1QA、C1QB基因在心臟、肝臟和腎臟中的表達量差異不顯著(P>0.05)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);相同字母表示差異不顯著。圖10-11同。

圖10 牦牛C1QB基因在不同組織中的相對表達量Fig.10 Tissue expression of C1QB gene in different tissues in Bos grunniens

圖11 牦牛C1QC基因在不同組織中的相對表達量Fig.11 Tissue expression of C1QC gene in different tissues in Bos grunniens

3 討論與結論

全世界約有牦牛1 600萬頭，中國是世界上擁有牦牛數量和品種類群最多的國家，約占世界牦牛總數的95%以上，占中國牛只總數的1/6。牦牛作為一種“全能”家畜，對人類有著不可忽視的社會及經濟意義。本研究通過對類烏齊牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因的克隆、生物信息學分析與組織表達分析，為今后補體C1q蛋白在牦牛低氧適應研究提供依據，同時也為開發和利用類烏齊牦牛遺傳資源奠定基礎。將類烏齊牦牛與水牛、普通牛、人、黑猩猩、卡氏小鼠、野豬、藏羚羊、非洲爪蟾、青藏高原蛙、斑馬魚和高原地山雀的核苷酸序列進行比對，發現牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因在反芻動物間具有高度保守性。

本研究顯示牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白甘氨酸含量為15.2%，13.4%，16.5%。甘氨酸含量越高，機體抗氧化應激的能力越強；另一方面，由于缺氧會導致體內C1q的沉積，C1q增多促使體內ROS增加，而甘氨酸作為內源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，對活性氧(ROS) 有很強的清除作用，因此，牦牛體內甘氨酸的含量影響其對高海拔低氧環境的適應。脯氨酸親水性極強，可降低凝固點防止細胞脫水從而能穩定生物大分子結構及組織內的代謝過程，同時作為能量庫調節細胞的氧化還原；在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，脯氨酸可作為抗寒育種的生理指標[37]。本研究表明，牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白脯氨酸含量為9.8%，9.3%，10.7%，表明類烏齊牦牛體內脯氨酸的含量可能是導致其適應高海拔低溫環境的重要因素。

信號肽是指導新合成的蛋白質的跨膜轉移(定位)的短肽鏈，可與膜上蛋白受體結合，指引蛋白質被運輸到特定位置，而結構域是生物大分子中具有特異結構和獨立功能的區域。本試驗預測到牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白含有C1Q結構域與一條信號肽，說明補體C1q蛋白的功能較保守，牦牛在補體系統經典途徑的免疫調節中與其他物種是一致的。胞內的信號蛋白主要分為兩大類：一類在蛋白激酶的作用下磷酸化，共價結合ATP所提供的磷酸基團；另一類則在信號作用下結合GTP，使得GTP取代GDP，這2種胞內信號蛋白會在信號達到時獲得磷酸基團而被激活，在信號減弱時去除這些基團，從而失活。在信號中繼網中，這種某個信號蛋白磷酸化從而造成下游蛋白依次發生磷酸化的過程稱為磷酸化級聯反應。而牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白磷酸化位點為18，21，15個且均有信號肽，說明牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白是信號蛋白，在細胞內和細胞間進行信號傳遞，協調和控制相關代謝和生命活動。近年來磷酸化在低溫脅迫上的研究數不勝數，Zhao等[38]利用蛋白磷酸化技術探究了低溫脅迫下植物生長發育的相關機制；楊梅燕[39]研究表明在凍融脅迫下，PM18蛋白可有效降低乳酸脫氫酶的活性喪失比率，且磷酸化后的PM18蛋白對乳酸脫氫酶的保護能力比非磷酸化的PM18蛋白更好，牦牛作為生存在高原低溫、低氧等惡劣環境下的優勢物種，探討牦牛低溫脅迫的調控機制有利于牦牛遺傳資源的開發與利用。

蛋白功能預測分析顯示，牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白的功能包括細胞表面受體信號通路的調控、基因表達調節、代謝過程的調節、細胞信號轉導、細胞定位等，這些功能預測與本研究對C1QA、C1QB和C1QC蛋白的生物信息學分析所得結果相對應。牦牛由于對高原環境的適應，在機體代謝上勢必與其他物種存在差異，牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白對于代謝過程的調節幾率達到了84.7%，84.0%和81.7%，但關于其對牦牛代謝過程的調控機制需進一步研究。蛋白質互作分析中，由于C1QA、C1QB和C1QC蛋白是補體C1q的構成蛋白，三者相關性達到了0.90以上，C1QC與補體第一成分的S亞成分(C1S)的相關性亦達到了0.901，是因為C1q的膠原樣區與兩分子的補體第一成分的r亞成分(C1R )和 C1S 結合而形成C1大分子(C1QC1R2C1S2)，再通過C1q球狀結構域識別與Ig G或IgM免疫復合體結合，激活C1R和C1S，進而啟動補體經典途徑。蛋白酪氨酸激酶是一類催化ATP上γ-磷酸轉移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質酪氨酸殘基磷酸化，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用；蛋白質互作顯示蛋白酪氨酸激酶結合蛋白(TYROBP)與C1QC間相關性達0.815，蛋白質磷酸化位點預測發現牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白酪氨酸磷酸化位點為2，3，2個，表明牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白有可能是通過酪氨酸磷酸化參與調控牦牛細胞生長、增殖與分化。

實時熒光定量PCR結果顯示，C1QA、C1QB基因在肺臟和脾臟中表達量最高，心臟、肝臟與腎臟三者間表達量差異不顯著(P>0.05)，與Jiang等[13]發現綿羊脾臟中表達量最高，其次是肺臟的研究結果基本一致；與Yue等[40]發現小鼠脾臟中表達量最高，在肺臟與肝臟、心臟和腎臟中的表達量差異不顯著的研究結果存在差異，說明C1QA、C1QB基因的組織表達具有物種特異性，反芻動物中C1QA、C1QB基因在肺臟中的表達量要高于肝臟、心臟和腎臟；而脾是重要的淋巴器官，可以制造免疫球蛋白、補體等免疫物質，發揮免疫作用，也是人體的“血庫”，當人體休息、安靜時貯存血液，當處于運動、失血、缺氧等應激狀態時又將血液排送到血循環中，以增加血容量，所以C1QA、C1QB基因在不同物種的脾臟中表達量都比較高；在牦牛肺臟組織中表達量與其他物種存在差異的原因可能是C1QA、C1QB基因參與調控牦牛肺部低氧適應機制。C1QC基因在肺臟中表達量極顯著高于脾臟和肝臟，在心臟與腎臟中表達量較低，與Jiang等[13]發現綿羊脾臟中表達量最高，其次是肺臟，及Yue等[40]發現小鼠脾臟中表達量最高，在肺臟與肝臟、心臟和腎臟中的表達量差異不顯著的研究結果存在差異，說明C1QC基因的組織表達也具有物種特異性，但C1QC基因在脾臟與腎臟中的表達量與在C1QA、C1QB基因中的相比，肺臟顯著高于脾臟，可能是因為C1QC基因在調控牦牛肺部低氧適應機制中承擔著不同的作用。

本研究首次從類烏齊牦牛肺臟組織中克隆出牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因，其CDS區全長分別為735，744，732 bp，分別編碼244，247，243個氨基酸；系統進化樹結果表明，C1QA、C1QB基因與普通牛、水牛親緣關系最近，C1QC基因則與人的親緣關系最近；熒光定量結果表明，C1QA、C1QB基因在脾臟、肺臟中的表達量極顯著高于心臟、肝臟和腎臟中的表達量(P<0.01)，C1QC基因則是肺臟中的表達量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的表達量(P<0.01)。試驗結果為深入研究C1QA、C1QB、C1QC基因在牦牛高原適應中的分子機制提供了基礎數據。