熒光壽命數據的相量分析及其應用*

林丹櫻 牛敬敬 劉雄波 張瀟 張嬌 于斌 屈軍樂

(深圳大學物理與光電工程學院, 光電子器件與系統教育部/廣東省重點實驗室, 深圳 518060)

1 引 言

隨著熒光標記技術的快速發展, 熒光顯微成像技術已成為生物醫學研究領域不可或缺的工具之一. 熒光壽命作為熒光的一個重要參量, 反映了熒光分子從激發態回到基態的退激發速率, 是熒光分子的固有特性, 其變化能非常靈敏地反映熒光分子所處微環境(如細胞微環境中的溫度、黏度、pH 值、離子濃度等)的變化情況[1]. 同時由于熒光壽命的測量可不受熒光探針濃度、激發光強度、光漂白等因素的影響, 相比強度測量更有利于實現定量化, 因此探測樣品中熒光壽命的分布和變化的熒光壽命顯微成像技術(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)常常被應用于定量測量細胞內的一些生物物理和生物化學參數[2,3], 或氣溶膠的黏度測量等[4]. 另一方面, 許多熒光團分子具有相似的熒光光譜, 假如利用它們對樣品中不同的結構進行特異性標記, 直接從光譜上很難分離, 但利用它們熒光壽命不同的特點, 可借助FLIM 技術對其熒光進行區分, 從而實現多結構的同時標記和成像. 這些特點使得FLIM 在生命科學研究中有著越來越廣泛的應用.

一般而言, FLIM 中熒光壽命的測量方法有時域法與頻域法兩類, 其中頻域法使用周期調制的連續光激發樣品, 檢測熒光信號相對激發光的振幅和相位變化來計算樣品的熒光壽命; 時域法采用高重復頻率的飛秒脈沖激光激發樣品, 利用門控技術、掃描相機技術、時間相關單光子計數(timecorrelated single photon counting, TCSPC)技術等記錄脈沖過后熒光信號的衰減過程并擬合或計算熒光壽命. 因此, 不管對于哪種類型的FLIM, 熒光壽命數據的處理都是非常關鍵的一環. 例如, 時域法熒光壽命數據最常用的處理方法是非線性最小二乘(nonlinear least-squares, NL-LS)擬合法,即選擇一種衰減模型(單指數、雙指數或多指數衰減)對每個像素點的測量數據進行曲線擬合, 然后分析出各衰減組分的熒光壽命值. 但是這種方法要求衰減模型的選擇要合適, 同時要求每個像素點要采集足夠多的光子數(通常 >1000)才能夠進行有效擬合[5]. 這就使得基于這種數據處理方法的FLIM 技術在應用上受到了相應的限制. 例如,TCSPC-FLIM 通常需要在激發光較弱的情況下進行成像, 以避免相鄰兩個脈沖之間檢測到的光子數多于1 而導致的光子堆積問題, 因此要求每個像素點采集足夠多的光子數就需要延長采集時間, 由此帶來的問題就是獲得一幅熒光壽命圖像的時間相對較長, 成像速度受限, 無法應用于一些熒光壽命變化速度較快的場合.

因此, 針對這些問題, 研究者們開發出了其他的算法, 例如相量分析(phasor analysis, PA)[6]、極大 似 然 估 計 (maximum likelihood estimate,MLE)[7]、一階矩(the first moment, M1)[8]、貝葉斯 分 析(Bayesian analysis, BA)[9]、壓 縮 感 知(compressed sensing, CS)[10]等, 這些方法可通過降低壽命分析對光子數的要求從而間接地提高FLIM 技術的成像速度[11]. 其中, PA 法通過將時域信息變換到頻域, 可直接計算得到熒光壽命值,簡單快速, 無需擬合, 且在低光子數情況下也能得到比較準確的壽命值, 適合于快速FLIM 成像. 另一方面, PA 法生成的相量圖能將具有相似熒光衰減特性的熒光團分子所對應的像素點顯示在相鄰區域, 形成一定的簇狀分布, 這種特點使得利用該方法可以更方便地對數據進行可視化和聚類分析,因此結合PA 法的FLIM 技術(phasor-FLIM)越來越受到科研人員的青睞, 在生命科學和生物醫學研究中應用越來越廣泛.

本文首先詳細闡述phasor-FLIM 的基本原理及使用方法, 并在此基礎上介紹該技術應用于細胞代謝狀態測量、蛋白質相互作用研究、細胞微環境測量以及輔助病理診斷和提高超分辨成像分辨率等方面的最新研究進展, 最后對其發展前景進行展望.

2 Phasor-FLIM 的基本原理

如前所述, FLIM 技術中熒光壽命的測量通常分為頻域法和時域法[1,6]. 這兩種方法在數學意義上互為傅里葉變換, 但它們獲取熒光壽命信息的方式不同, 得到的數據內容和形式不同, 從而數據處理方法一般也不同. 頻域法一般使用正弦調制的連續光激發樣品, 測量得到的是具有相同頻率的熒光信號, 但由于熒光壽命的影響, 熒光信號的振幅和相位相比激發光均發生了變化, 因此通過計算熒光信號相對激發光的振幅調制度變化和相位延遲可計算得到熒光壽命. 而時域法則需要采用高重復頻率的飛秒脈沖激光激發樣品, 利用前面提到的門控技術、掃描相機或TCSPC 技術等直接或間接記錄脈沖過后的熒光衰減過程, 得到的是熒光強度(或光子數)隨時間的變化關系, 因此一般可通過曲線擬合得到熒光壽命.

PA 法最先被用于處理頻域FLIM 技術得到的熒光壽命數據, 其相量由頻域FLIM 測量得到的解調系數和相位延遲來構建, 是原始數據的直接表達[12]. PA 法同樣適用于時域FLIM 數據的分析,但需要先將時域的熒光衰減變換到頻域. 由于時域FLIM 中的TCSPC-FLIM 目前應用最為廣泛,因此PA 法在該技術中的應用也是報道得最多的.以下分別介紹這兩類技術中PA 法分析熒光壽命的基本原理, 并結合熒光相量圖的特點闡述其典型的應用思路.

2.1 頻域法FLIM 及其相量分析

在頻域FLIM 中, 激發光常采用正弦調制的連續光源, 如激光、氙燈、LED 燈等, 激發光強可描述為

其中E(0)和E(t)分別為起始時刻和t時刻的激發光強度,ME=a/A為激發光的強度調制度(a和A分別是激發光的振幅和平均強度, 如圖1(a)所示),w為調制的角頻率. 利用該激發光激發標記有熒光團的樣品后, 所檢測到的熒光也是正弦調制的, 且其頻率與激發光相同, 但強度調制度會降低,相位也有一定延遲. 如果熒光衰減符合單指數衰減規律, 則熒光光強可描述為

圖1 熒光壽命的測量方法及相量分析(PA)法示意圖 (a)頻域法測量原理示意圖; (b)單指數衰減的壽命相量示例圖; (c)雙指數衰減的壽命相量示例圖; (d)時間相關單光子計數(TCSPC)測量原理示意圖Fig. 1. Schematic diagram of fluorescence lifetime measurement and phasor analysis (PA): (a) Frequency domain method; (b) lifetime phasor of single-exponential decay; (c) lifetime phasor of bi-exponential decay; (d) time-correlated single photon counting (TCSPC) method.

相應地,I(0)和I(t)分別為起始時刻和t時刻的熒光強度,MF=b/B為熒光的強度調制度(b和B分別是熒光的振幅和平均強度, 如圖1(a)所示),f為相位延遲或相移. 通過測量相移f和解調系數M=MF/ME, 即可計算出相應的熒光壽命, 即:

可以證明[12,13], 當熒光的衰減過程符合單指數衰減規律(即I(t) =I(0)e–t/t,t為壽命)時, (3)式和(4)式算得的壽命tf和tm是相等的, 理論上只需要計算其中一個即可. 但假如熒光的衰減過程是兩個或多個單指數衰減過程的組合(即雙指數衰減或多指數衰減), 則情況更加復雜, 通常需要先在不同調制頻率wi下重復測量多組fi和Mi, 并通過以下公式先計算出等效相移和解調系數再求解壽命, 即:

其中fi為第i個調制頻率測得的光強占總光強的比例.

1984 年, Jameson 等[13]利用相量的概念對頻域法FLIM 得到的數據進行幾何表示, 他們利用單個像素點對應的解調系數M和相移f來構建一個相量, 即以M作為該相量的模, 以f作為該相量的輻角, 則可以認為相量與像素點是一一對應的, 相量圖上一個相量的端點就代表了一個像素點的全部熒光壽命信息(如圖1(b)所示). 該相量在實軸和虛軸的分量可用Weber 符號表示[14], 即:

對于單指數衰減情形, 由(3)式和(4)式可得到cosf=M, 因此可以得到:

即以坐標(G,S)表示的相量端點被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上. 半圓上的每個點表示不同的壽命, 壽命值從左到右遞減, 其中(1, 0)表示接近零的壽命, (0, 0)表示無限長的壽命, 如圖1(b)所示.

幾何意義上, 多指數衰減過程對應的相量端點應位于其各個單指數衰減組分對應的壽命相量端點連接組成的集合內. 如圖1(c)中, 雙指數衰減過程對應的壽命相量端點(藍色)落在半圓以內, 位于兩個單指數衰減組分對應的壽命相量端點(綠色)的連線上, 且與兩端點的距離(p1,p2)由兩個組分的占比(a1,a2)決定.

2.2 時域法FLIM 及其相量分析

PA 法同樣適用于時域法FLIM 數據的分析.這里以目前應用最廣泛的TCSPC-FLIM 技術為例. 如圖1(d)所示, TCSPC 將每一次脈沖信號作為一個信號周期, 每個周期內當探測到第一個熒光光子時就在其到達時間對應的時間通道中進行計數, 經過多次累積即可建立一個反映熒光衰減過程的光子數-時間分布直方圖, 用于求解熒光壽命.

2008 年, Digman 等[16]將Weber[14]于1981年提出的熒光脈沖響應的傅里葉分析方法用于TCSPC 技術, 并使用以下關系式計算相量端點坐標, 也可以將每個像素的全部熒光衰減信息轉換為相量圖上的單個點, 即:

其中G(w)和S(w)分別是熒光脈沖響應傅里葉頻譜的實部和虛部, 這里用作壽命相量的兩個分量;I(t)是脈沖過后t時刻的熒光光強,w是脈沖激光的角頻率,T是周期長度(實際可取動態范圍),n是諧波的階次, 一般情況下取基頻分量, 即n=1. 因為TCSPC 是在N個離散的時間通道tk中記錄熒光衰減分布直方圖的, 因此上述積分運算可轉化為求和計算:

其中Ck是第k個時間通道記錄的光子數,是所有時間通道記錄的總光子數.

如果熒光脈沖響應呈單指數衰減規律, 則代入(11)式可得G(w)和S(w)與熒光壽命t的關系為:

可以驗證,G,S仍然滿足(8)式的關系, 即單指數衰減情形下以坐標(G,S)表示的相量端點仍被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上, 與頻域法得到的相量圖一致.

而如果熒光脈沖響應是呈多指數衰減的, 則同樣根據線性疊加關系可知, 坐標(G,S)表示的相量端點也位于半圓以內, 其中雙指數衰減過程對應的相量端點也在其兩個單指數衰減組分對應的相量端點連線上, 與頻域法得到的結論一致.

2.3 相量圖的特點及其典型應用思路

如前所述, 對于滿足單指數衰減規律的情形,熒光壽命相量圖上以坐標(G,S)表示的相量端點被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上, 而多指數衰減過程的相量端點則位于半圓以內, 具體地說, 是位于各單指數衰減組分相量端點連接組成的集合內. 例如, 對于雙指數衰減情形,其壽命相量端點位于兩個單指數衰減組分相量端點的連線上, 且位置與兩個組分的占比有關. 相量圖的這些特點, 使得其在熒光壽命數據的定量分析、可視化和聚類分析方面有很大優勢.

如前所述, 熒光壽命反映的是熒光分子從激發態回到基態的退激發速率, 因此當處于激發態的熒光分子所處的微環境不同, 或者熒光分子與其他分子發生相互作用和能量轉移時, 熒光壽命會發生靈敏的變化. 所以, 許多熒光團存在兩個甚至兩個以上的衰減速率, 分別對應于熒光團的不同狀態, 例如細胞內的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)處于自由態時(主要位于細胞質中)的熒光壽命為幾百皮秒(t1), 與蛋白質綁定后處于結合態時(主要位于線粒體中)的熒光壽命則達到幾納秒(t2)[6].2005 年Brid 等[17]利用干擾NADH/NAD+比例的代謝藥物氰化鉀(Potassium cyanide, KCN)阻斷細胞的呼吸作用, 證明了細胞中自由態和結合態NADH 的占比與NADH / NAD+比例有關, 從而提出利用FLIM 測量自由態和結合態NADH 的比例, 來間接獲得活細胞內的NADH/NAD+比例.NADH 與其氧化形式NAD+作為生物體內許多氧化還原反應的輔酶參與生命活動并相互轉化, 它們之間的平衡反映了氧化磷酸化和糖酵解的比率, 因此NADH/NAD+比例及其變化可用于監測細胞代謝方式的變化. 對于細胞內NADH/NAD+比例的探測, 傳統的方法有酶循環法、毛細管電泳法、質譜分析法等, 但這些方法只適用于對細胞提取物進行檢測. 直接對細胞內NADH/NAD+比例進行探測也可以采用熒光強度成像的方法, 這是因為NADH 發熒光而NAD+不發熒光. 但由于熒光團濃度的不均一性以及自由態和結合態NADH 熒光量子產率的不同, 基于強度成像的NADH/NAD+測量結果通常存在較大誤差. Brid 等[17]的工作為定量監測活細胞內NADH/NAD+的比例提供了一種新的思路, 即通過FLIM 定量測量自由態和結合態NADH 的比例來間接獲得NADH/NAD+比例. 他們的研究還表明, 當NADH/NAD+比例發生變化時, 自由態和結合態NADH 的熒光壽命值(即t1和t2)幾乎保持恒定, 變化的是它們各自的占比(即a1和a2). 多指數衰減情形的壽命相量與其各個單指數衰減組分壽命相量之間的線性關系,使得采用了PA 法分析熒光壽命的phasor-FLIM 特別適合于在已知單指數衰減組分壽命的前提下, 對多組分尤其是雙組分中不同組分的占比進行定量分析. 所以, phasor-FLIM 的典型應用之一, 就是根據壽命相量端點的位置對NADH 兩種壽命組分的占比進行定量分析, 從而用于細胞代謝狀態的測量[18?27].

此外, 在利用熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)對蛋白質相互作用進行研究的FLIM-FRET 實驗, 以及一些利用FLIM 研究細胞微環境參量變化的場合, 也會涉及到雙指數衰減甚至多指數衰減及其組分占比的變化, 因此phasor-FLIM 在這些應用中的報道近幾年也多了起來[28?34].

其次, PA 法生成的相量圖中, 具有相似熒光衰減特征的像素點所對應的相量端點會顯示在相近的位置, 因而形成一定的簇狀分布(如圖2(a)和圖2(b)所示), 稱為“相量簇”. 同一個相量簇對應于具有相似熒光衰減特性的多個像素點, 但這些像素點在樣品中的分布可以是不連續的, 和它們的空間分布并沒有直接聯系. 利用該特點, 可在相量圖上選取感興趣的相量簇, 并通過其對應關系找到相量簇中各相量端點所對應的像素點在樣品上的位置, 就可以方便地將樣品中具有相似熒光壽命特征的區域標記出來(如圖2(c)所示), 還可以進一步對這些熒光壽命特征相似的區域進行聚類分析, 從而為研究一些生物醫學問題帶來極大的便利[18?20].倘若對不同的相量簇對應的像素點賦以不同的偽彩色, 則利用該方法還可以方便地實現熒光壽命圖像的多色顯示(如圖2(d)所示), 從而起到輔助病理判斷等作用[35?37]. 最近, 這種利用PA 法對熒光壽命的分布進行聚類分析的方法還被應用于輔助提高基于受激輻射耗盡(stimulated emission depletion, STED)的超分辨成像的分辨率[38?40].

圖2 Phasor-FLIM 的應用思路示意圖 (a)包含未處理壽命信息的熒光強度圖; (b)經PA 法分析得到的壽命相量圖; (c)對壽命相量直接進行分析; (d)通過相量聚類分析和偽彩色標記得到的熒光壽命圖Fig. 2. Schematic diagram of phasor-FLIM application:(a) Fluorescence intensity image with untreated lifetime information; (b) lifetime phasor plot obtained by PA analysis;(c) direct analysis of lifetime phasors; (d) phasor-mapped FLIM image based on phasor clustering analysis and pseudo-color assignment.

綜上, 目前phasor-FLIM 的應用可以用圖3來表示. 以下將舉例說明phasor-FLIM 的應用研究進展.

圖3 Phasor-FLIM 的應用分類示意圖Fig. 3. Application classification diagram of phasor-FLIM.

3 Phasor-FLIM 的應用研究進展

3.1 基于NADH 的細胞代謝應用研究

細胞的能量主要來自細胞呼吸, 正常細胞或正常分化的細胞在有氧條件下采用糖酵解進行代謝,缺氧條件下通過氧化磷酸化進行代謝. 而高度增殖的細胞(如癌細胞或干細胞)即使在氧氣充足的條件下也多選擇糖酵解作為主要的產能方式, 這種現象被稱為“Warburg 效應”[41]. 而這種細胞代謝方式的不同導致兩者所含NADH 的濃度和狀態存在差異. 因此基于前面提到的NADH 處于兩種不同狀態具有不同熒光壽命的特性, 以NADH 作為內源熒光標志物的雙光子FLIM 成像常被用于研究正常細胞、干細胞、癌細胞以及其他疾病發生時細胞的代謝差異, 而結合了PA 法的phasor-FLIM可方便地實現活組織中單細胞代謝表型的觀測, 在細胞分化和增殖、疾病的機理研究和診斷等方面均具有很好的應用前景, 目前也取得了一些重要的應用研究進展.

細胞分化和增殖過程會改變糖酵解和氧化磷酸化之間的平衡, 所以代謝變化可用于研究細胞分化和增殖狀態. Stringari 等[18?20]通過對細胞內包括NADH 在內的各種內源性熒光標志物進行FLIM 成像, 并利用PA 法對FLIM 圖像進行分割,可以區分膠原蛋白、視黃醇、視黃酸, 以及處于自由態和結合態的NADH. 他們對小腸進行雙光子FLIM 成像并對利用PA 法得到的壽命相量簇進行聚類分析, 用來識別高度增殖的小腸干細胞, 通過代謝狀態對小腸干細胞和分化的后代進行分類分析, 以監測與代謝變化相關的生理(病理)過程.Lee 等[21]對白細胞和白血病細胞進行FLIM 成像,因為白血病細胞快速增殖, 糖酵解占主導地位, 壽命相量簇向短壽命方向移動, 利用PA 法定量分析自由態和結合態NADH 比例的變化, 可從血液中快速篩選和分離白血病細胞. 與傳統的生物分子診斷技術相比, 這種基于phasor-FLIM 的單細胞篩查方法對細胞友好, 具有臨床篩選血液細胞的潛力. 細胞外基質(extracellular matrix, ECM)是所有組織必不可少的動態組成部分, 并通過提供機械和生化信號來直接影響細胞行為. ECM 的變化可以改變組織的動態平衡, 從而潛在地促進細胞轉化和腫瘤的發生. Romero-Lopez 等[22]將正常細胞接種在提取自正常人結腸和轉移至肝臟的結腸腫瘤的ECM 中, 利用phasor-FLIM 技術定量分析了自由態和結合態NADH 的比例, 結果發現接種在腫瘤ECM 中的細胞比接種在正常ECM 中的細胞具有更高的游離NADH 水平, 糖酵解速率較高, 表明ECM 在癌細胞及其相關脈管系統的生長中起到了重要作用.

圖4 Phasor-FLIM 用于分析細胞在缺氧和線粒體毒性藥物氰化鉀刺激下NADH/NAD+比例的變化, 研究代謝狀態的轉變[27]Fig. 4. Phasor-FLIM was used to analyze the change of NADH/NAD+ ratio under the stimulation of hypoxia and mitochondrial toxic drug potassium cyanide, for studying the change of metabolic state of cells[27].

由于許多疾病的發病機制與細胞代謝也有著密切的關聯, phasor-FLIM 在疾病的機理研究及診斷方面也有不少應用實例. 例如, 亨廷頓病(Huntington’s disease, HD)是一種常染色體神經退行性疾病, 能量代謝障礙是HD 的主要發病機制. Sameni 等[23]使用phasor-FLIM 來定量測量HD 中自由態和結合態NADH 的比例變化, 作為活細胞代謝變化的間接測量, 用以研究HD 發病機制, 結果表明HD 的代謝障礙為糖酵解增加, 導致氧化應激和細胞死亡. 這種定量分析的方法可用于篩選HD 組織并進行潛在的藥物篩選, 對診斷和治療疾病具有重要意義. 阿茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)是一種老年人多發的神經退行性疾病, 與抗氧化保護降低和線粒體功能障礙有關.Dong 等[24,25]使用雙光子激發FLIM 技術結合PA 法定量分析了老年小鼠海馬區神經元游離NADH 的水平, 結果發現隨著年齡的增加, 游離的NADH 濃度降低, 氧化磷酸化占據主導地位,AD 進一步惡化, 而還原性治療可恢復老年小鼠及AD 小鼠神經元中游離NADH 的水平. Hato 等[26]則采用類似的方法對活體小鼠腎臟進行雙光子FLIM 成像, 使用PA 法分析腎臟中的代謝變化,提供了一種研究腎臟疾病代謝的方法. Datta 等[27]通過雙光子FLIM 對人誘導多能干細胞分化的心肌 細 胞(human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes, hiPS-CMs)進行成像, 檢測缺氧和線粒體毒性藥物氰化鉀病理刺激下代謝狀態的變化. 如圖4 所示, 缺氧狀態下和用藥物刺激時hiPS-CMs 的壽命相量分布向自由態NADH的方向移動, 代謝方式轉變為糖酵解. 這種非侵入性成像技術有助于研究心臟病的發病機理和治療方法[27].

3.2 基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究

當一個熒光分子(供體)的熒光發射光譜與另一個熒光分子(受體)的激發光譜相重疊, 且兩者間的距離合適(一般為6—10 nm)時, 供體的激發能誘發受體發出熒光, 同時其自身的熒光強度發生衰減, 稱為FRET 效應. 由于該效應發生的程度(即FRET 效率)與供體和受體的距離緊密相關,該效應常被用于研究蛋白質間的相互作用(簡稱“蛋白互作”). 具體的做法是將供體熒光分子和受體熒光分子分別標記于兩個蛋白質分子上, 通過測量FRET 效率來反映兩個蛋白質之間的距離, 從而反映其是否發生相互作用以及相互作用的程度.從熒光壽命的角度看, 當FRET 效應發生時, 由于供體將能量轉移到受體上, 供體的熒光壽命將變短. 考慮到FLIM 測量不受光漂白等因素的影響,利用FLIM 進行FRET 效率的測量比測量熒光強度變化的方法要更加準確, 因此FLIM-FRET 已被廣泛應用于蛋白互作的研究. 發生和不發生FRET(或者說FRET 效率很高和很低)兩種狀態下供體的壽命可認為是不變的, 相當于兩個單指數衰減組分, 因此根據PA 法的分析, 兩種狀態下得到的壽命相量應位于半圓上. 而當部分供體發生FRET 時, 總體的熒光衰減滿足雙指數衰減規律,壽命相量端點將位于上述兩個單組分壽命相量端點的連線上, 且到兩端的距離與兩種組分的占比有關, 由此可方便地計算出FERT 效率. 2012 年和2013 年, Hinde 等[28,29]利 用 phasor-FLIM 和FRET 監測了小G 蛋白與RBD 蛋白在溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)刺激下相互作用的變化, 結果表明, 在熒光強度圖像看不出明顯差異的情況下, FLIM 圖像和PA 定量分析均顯示小G 蛋白與RBD 蛋白的標簽蛋白EPCF 和Critine在LPA 刺激下FRET 效率顯著增加(如圖5 所示). Lou 等[30]在 共 表 達H2B-eGFP 和H2BmCherryrry兩種熒光蛋白的Hela 細胞中利用phasor-FLIM 測得的FRET 效率對核小體的緊實度進行了量化, 用于定量反應DNA 的損傷情況.

圖5 Phasor-FLIM 用于定量測量RhoA-kRas 單鏈生物傳感器的熒光共振能量轉移(FRET)效率, 研究蛋白互作[28]Fig. 5. Phasor-FLIM was used in quantitative FRET efficiency detection of a RhoA-kRas single chain biosensor, studying interaction between proteins[28].

3.3 基于敏感探針的細胞微環境參量測量

由于熒光壽命與熒光分子所處的微環境密切相關, 因此采用一些對細胞中某種微環境參量(如溫度、pH 值、離子濃度、黏度等)特別敏感的熒光探針對這些微環境參量及其變化進行定量測量是FLIM 的常規應用. Chen 等[31]將PA 法應用于溫度的FLIM 測量, 通過熒光分子羅丹明B 的壽命相量圖定量分析比較了Hela 細胞在8 種不同溫度下壽命相量簇的分布變化. Battisti 等[32]采用具有pH 依賴性的熒光團E2GFP, 利用phasor-FLIM 將所有的實驗圖像在同一個相量圖上進行比較, 從而分析細胞在生理狀態和非生理狀態下pH 值的變化(如圖6 所示). 深圳大學Zhou 等[33]使用phasor-FLIM 分析監測了pH 敏感的細胞間納米藥物的釋放. 他們合成聚合物納米顆粒PAHCit/DOX, 用于阿霉素(DOX)在癌細胞中的有效釋放, 并對其釋放過程進行了監測. 具體來說, 這種PAH-Cit/DOX 納米顆粒在生理pH 下穩定, 但在弱酸性條件下能夠有效釋放DOX. 同時, 他們采用phasor-FLIM 對該納米粒子在癌細胞中釋放DOX 的熒光壽命進行了監測, 從而提供了一種評估納米載體藥物釋放效率的方法. Ferri 等[34]則開發了一種基于BODIPY 的黏度敏感熒光分子BoMe, 將BoMe 與phasor-FLIM 相結合用于評估早衰綜合癥(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)細胞內的黏度.

3.4 輔助病理診斷

圖6 Phasor-FLIM 用于分析細胞在正常(靜止)狀態和氧化應激狀態下pH 值的變化[32]Fig. 6. Phasor-FLIM was used to analyze the changes of pH value of cells in normal state (at rest) and under oxidative stress[32].

非黑色素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancers, NMSC)是白種人群體中最常見的腫瘤疾病, 光化性角病(actinic keratosis, AK)、博文病(Bowen disease, BD)、基 底 細 胞 癌(basal cell carcinoma, BCC)和浸潤性鱗狀細胞癌(invasive squamous cell carcinoma, SCC)都是其常見的亞型. 該類型皮膚疾病的臨床癥狀很不明顯, 因而采用活組織實現對NMSC 的診斷比較困難, 目前臨床上主要是通過對蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin, H&E)染色切片的形態學特征分析來進行診斷. 但這種方法鑒別與診斷上述不同NMSC亞型的準確性通常與病理學家的專業知識、技能和經驗有關, 可能會導致不同人員鑒別與診斷的結果存在巨大差異, 主觀性大, 出錯概率較高, 影響后續治療. 2017 年, 深圳大學的Luo 等[35]對H&E 染色的皮膚病理切片進行了雙光子FLIM 成像, 并結合PA 法定量分析了AK, BD, BCC 這三種類型的皮膚腫瘤對應的壽命相量簇分布情況, 結果表明不同皮膚腫瘤疾病的壽命相量簇其坐標值、角斜率、相量面積分布均存在差異, 提示phasor-FLIM 技術可為鑒別診斷這些皮膚腫瘤疾病提供一種簡便可行的組織病理學分析方法, 其準確性和客觀性相對于明場H&E 診斷將有顯著提高. 此外,他們還采用PA 法對H&E 染色的BCC 細胞切片的熒光壽命數據進行了半定量分析[36], 并通過聚類分析對不同的相量簇賦以不同的偽彩色, 從而使FLIM 圖像上的病理學特征更加明顯, 可進一步輔助病理診斷和促進細胞病變及發展機理方面的深入研究(如圖7 所示).

輸尿管的阻塞會增加腎小管的壓力, 降低腎小球的濾過率, 并通過腎臟激活許多血管活性激素和細胞因子, 導致纖維化. 臨床上常用Picrosirius 紅或Masson Trichrome 染色的組織切片, 依靠病理學家專業的知識來診斷間質纖維化. Ranjit 等[37]利用phasor-FLIM 研究了小鼠腎臟單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)纖維化的發展過程, 根據相量分布的平均位置、形狀、角度和數目, 區分了健康組織和病變的纖維化組織,同時可以從FLIM 圖像定量得到纖維化程度, 可用于監測疾病發展或治療效果.

3.5 提升超分辨成像分辨率

圖7 Phasor-FLIM 聚類分析和偽彩色標記用于增強H&E 染色基底細胞癌(BCC)切片病理學特征的可視化, 可輔助病理診斷[36]Fig. 7. Phasor-FLIM clustering analysis and pseudo-color assignment was used to enhance visualization of pathological features of basal cell carcinoma (BCC) sections stained with H&E, assisting pathological diagnosis[36].

圖8 Phasor-FLIM 聚類分析用于濾除受激輻射耗盡(STED)成像中環形擦除光區域的光子, 可輔助提升超分辨成像分辨率[39]Fig. 8. Phasor-FLIM cluster analysis was used to filter out the photons in the annular depletion region in stimulated radiation depletion (STED) imaging, improving the resolution of super-resolution imaging[39].

STED 技術是近年來發展起來的一種超分辨顯微成像技術, 在“突破”分辨率極限和相關應用方面都取得了顯著成果[42]. 該技術使用高強度環形擦除光使衍射極限范圍內除中心點以外的熒光分子發生受激輻射而不產生熒光(稱為“擦除”), 從而有效減小系統的點擴散函數獲得超分辨率. 提高擦除光功率可進一步提高分辨率, 但代價是增加了光漂白、光毒性和反斯托克斯發射背景, 從而降低了信噪比, 并嚴重限制了STED 技術在活細胞成像中的應用. STED 中擦除光的作用, 是使處于激發態的粒子發生受激輻射而迅速躍遷回基態, 相當于縮短了這部分熒光分子的壽命. 因此, 受到擦除光照射的熒光分子與未受到擦除光照射的熒光分子會分布在相量圖中的不同位置, 對壽命相量進行聚類分析, 可將兩種狀態下的熒光分子分離. 2015年, Lanzanò等[38]利用該原理, 將phasor-FLIM與STED 結合, 在較低擦除光功率的條件下通過濾除掉環形區域的光子實現了與較高擦除功率相當的分辨率. 2018 年, 深圳大學的Wang 等[39]也將phasor-FLIM 應用于STED, 通過只選擇激發光斑中心未被擦除光照射的目標光子進行圖像重構, 從而在不增加擦除光能量的前提下成功將 光 子 進 行 分 離, 將 分 辨 率 從150 nm 提 升到80 nm (如圖8 所示). 類似地, Tortarolo 等[40]也利用PA 法實現了光子分離, 提出了pSTEDSPLIT 方法, 在不增加擦除光功率的前提下可有效提高分辨率.

4 總結與展望

FLIM 技術通過采集熒光探針分子的壽命信息進行成像, 具有特異性強、靈敏度高、可定量測量的優勢, 常用于探測細胞微環境參量分布、能量代謝狀態, 表征材料內部結構及性質等方面, 因而在生物醫學、材料學等諸多領域有廣泛的應用. 為了從采集到的大通量壽命數據中快速精準地獲取樣品內部的結構與功能信息, 發展一種簡單快速而且實用的壽命數據分析方法在實際生物醫學應用中具有重要的意義. 近些年興起的PA 法在頻域計算壽命, 無需擬合, 分析簡便, 對科研人員的專業知識背景要求不高, 因此發展和應用均非常迅速.相比傳統的NL-LS 擬合, 該方法不僅分析速度快,相同壽命精度下要求的采集光子數少, 間接縮短了數據采集時間, 有利于發展快速FLIM 成像技術,而且能將具有相似衰減特征的像素點以“相量簇”的形式呈現, 具有強大的數據可視化功能, 也便于對數據進行聚類分析等, 因而在基于NADH 的細胞代謝狀態測量、基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究、基于敏感探針的細胞微環境參量測量和輔助病理診斷、提升超分辨成像分辨率等方面均取得了很好的應用研究進展. 基于此, 本文詳細闡述了PA 法的基本原理及其運用方法, 并在此基礎上介紹了運用PA 法的phasor-FLIM 在上述幾個方面的應用實例, 著重討論了PA 法在這些FLIM 應用實例中的優勢所在, 為相關領域的研究提供有益的參考.

然而, 盡管近年來phasor-FLIM 在實際應用中已經取得了許多重要的研究進展, 但與此同時還存在一些局限性. 例如, 雖然PA 處理時對采集光子數的要求要比傳統擬合算法低很多, 但是在快速FLIM 成像時當采集的光子數較少或信噪比較差時, 其相量簇的分布就會比較雜散, 據此分析得到的結果可靠性往往不夠高. 為了解決這一問題,目前已有報道將中值濾波、小波變換等圖像處理方法應用于對低信噪比的壽命數據進行預降噪處理,以提高熒光壽命分析的精度. 此外, 為了獲取可靠的熒光壽命計算結果, PA 法處理前通常需要利用系統的儀器響應函數加以校準, 相比無需校準的衰減曲線尾部擬合的方法要多一個步驟, 對非專業人員而言有時候不夠便利. 但是即便如此, 相信隨著生命科學對快速定量成像需求的日益增加以及PA 法的進一步發展完善, phasor-FLIM 一定會有越來越廣泛的應用前景, 在生物醫學等領域發揮越來越重要的作用.