薺苧黃酮通過抑制氧化應激和炎癥改善高原缺氧誘導的小鼠腦組織損傷

劉 睿，邵 瑾，趙 彤，何 蕾，馬慧萍，景臨林*

1聯勤保障部隊第九四〇醫院干部病房；2聯勤保障部隊第九四〇醫院藥劑科 全軍高原醫學重點實驗室，蘭州 730050

高原約占地球表面的五分之一，而世界上約有1.4億人生活在海拔超過2 500 m的高原，其中，我國約有800萬人生活在平均海拔4 000 m以上的青藏高原[1]。大量研究表明：暴露于高海拔引起的低壓低氧(hypobaric hypoxia，HH)環境下會對人體的病理生理變化產生嚴重影響[2]。其中，腦組織由于耗氧量大，是對缺氧最為敏感的器官之一[3]。隨著中國經濟的快速發展和人民生活水平的不斷提高，奔赴高原進行工作、旅游和探險的人越來越多，如何改善低壓低氧誘導的腦組織損傷成為目前研究的熱點問題。

薺苧黃酮(5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮；mosloflavone)(圖1)是首次從蘇州薺苧(MoslasoochowensisMatsuda)分離得到的一種黃酮化合物[4]。研究表明：薺苧黃酮具有抗氧化、抗炎和抗病毒等活性[5-7]。課題組前期研究發現：薺苧黃酮對缺氧PC12細胞具有明顯的保護作用[8]，進一步通過動物實驗證明其還能夠改善高原缺氧誘導的小鼠腦組織損傷[9]，但是具體的作用機制尚不明確。有證據表明：急性低壓缺氧能夠誘導腦組織中活性氧(ROS)的增加[10]和炎性因子的釋放[11]，本研究將探究薺苧黃酮對低壓低氧誘導小鼠腦組織氧化應激和炎性反應的影響，闡明其可能的作用機制。

圖1 薺苧黃酮的結構Fig.1 Chemical structure of mosloflavone

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

雄性清潔級BABL/c小鼠(4周齡，體重20±2g)，由聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗科提供，許可證號:SYXK(軍)2014-0029。

1.2 藥物與試劑

薺苧黃酮按照文獻方法制備，純度>98%[8]；蘆丁購自陜西慈緣生物技術有限公司，純度>98%。丙二醛(MDA，批號：20 150 812)測試盒、BCA法蛋白定量試劑盒(批號：20 150 921)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20 150 724)測試盒、過氧化氫酶(CAT，批號：20 150 613)測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號：20 150 802)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)購自sigma公司；白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自Abcam公司。IL-1β、TNF-α、SOD1、CAT和β-actin等一抗購自Abcam公司；羊抗小鼠IgG-HRP抗體和羊抗兔IgG-HRP抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL Plus超敏發光液和PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

FLYDWC50-IIC低壓低氧動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)；CriterionTM電泳槽(Bio-Rad公司)；Spectramax i3多功能酶標儀(Molecular Devices公司)；BPG-9 040精密鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；Microfuge 22R冷凍離心機(Beckman Coulter公司)；多樣品組織研磨儀Tissuelyser-24(上海凈信實業發展有限公司)。

2 方法

2.1 常壓密閉缺氧實驗

清潔級健康BABL/c雄性小鼠50只，隨機分為缺氧模型組、蘆丁組(500 mg/kg)和薺苧黃酮低(125 mg/kg)、中(250 mg/kg)、高(500 mg/kg)劑量組，每組10只，連續灌胃給藥5天，缺氧模型組給予等量生理鹽水，最后一次給藥后半小時后，將小鼠置于250 mL廣口瓶中(瓶中放置5 g鈉石灰用于吸收CO2)，密閉瓶塞后開始計時，以小鼠最后一次大喘氣為死亡指征，紀錄小鼠存活時間，計算存活率=(給藥組存活時間-模型組存活時間)/模型組存活時間。

2.2 低壓低氧誘導腦組織損傷模型

低壓低氧誘導腦組織損傷模型的構建參照課題組先前報道的方法進行[12]。清潔級健康BABL/c雄性小鼠84只，隨機分為正常對照組、缺氧模型組、蘆丁組(500 mg/kg)、薺苧黃酮組(500 mg/kg)，每組21只，連續灌胃給藥5天。正常對照組小鼠不給藥，缺氧模型組給予等量生理鹽水，最后一次給藥后，除正常對照組外，將其它三組小鼠置于低壓低氧動物實驗艙中，以10 m/s的速度升至海拔8 000 m并維持12 h，隨后以10 m/s的速度將實驗艙中氣壓升至于外界大氣壓，迅速處死小鼠，摘除腦組織，并按照測定要求對其進行處理。

2.3 腦組織含水量測定

每組分別取12只小鼠的腦組織標本，平均將其分成兩個半球。用精密電子天平稱量左半球的重量以獲得濕重。然后在80 ℃下干燥72 h，以達到恒定的干重。大腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.4 腦組織中ROS水平測定

每組分別取6只小鼠的腦組織右半球標本，用RIPA裂解液處理后，14 000 rpm低溫(4 ℃)離心20 min取上清。將10 μM DCFH-DA的加入上清液中，37 ℃避光孵育15 min，測定激發波長535 nm，發射波長538 nm的吸光度值。ROS水平以相對于對照組的百分比表示。

2.5 腦組織中氧化應激相關指標的測定

每組分別取6只小鼠的腦組織右半球標本，稱重后加入9倍量冰生理鹽水，使用組織研磨儀制備腦組織勻漿，然后3 500 rpm低溫(4 ℃)離心10 min后取上清。MDA和GSH含量以及SOD、CAT和GSH-Px活性的按照相關試劑盒說明書進行測定。MDA含量和GSH含量分別以nmol/mg protein和μmol/g protein表示，SOD、CAT和GSH-Px活性以U/mg protein表示。

2.6 腦組織中炎性因子含量測定

每組分別取6只小鼠的腦組織標本，用RIPA裂解液處理后，3 500 rpm低溫(4 ℃)離心5 min。上清液中IL-1β，TNF-α和IL-6的濃度按照相關ELISA試劑盒說明進行測定。炎性因子含量以pg/mL表示。

2.7 腦組織蛋白表達水平的測定

每組分別取3只小鼠的腦組織標本，稱重后加入9倍量RIPA裂解液，使用組織研磨儀制備腦組織勻漿，然后12 000 rpm低溫(4 ℃)離心15 min，取上清，采用BCA法計算蛋白濃度。取等量蛋白樣品上樣，采用SDS-PAGE進行分離，然后將蛋白轉至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別加入SOD1(1∶5 000)、CAT(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、TNF-α(1∶3 000)和β-actin(1∶1 000)等一抗，4 ℃搖床孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，β-actin蛋白使用羊抗小鼠IgG-HRP(1∶2 000稀釋)，其余均用羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，ELC發光，暗室曝光，灰度值用Image-Pro Plus6.0軟件掃描測定。

2.8 統計學處理

3 結果

3.1 薺苧黃酮對常壓密閉小鼠腦存活時間的影響

與缺氧模型組相比，薺苧黃酮低、中、高三個劑量組均能延長小鼠在常壓密閉缺氧環境中的存活時間，且呈劑量依賴性，其中薺苧黃酮高劑量組的存活延長率達到49%，結果見表1。因此，后續實驗中薺苧黃酮的給藥劑量為500 mg/kg。

表1 薺苧黃酮對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響

圖2 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織含水量的影響Fig.2 Effects of mosloflavone on brain water content in mice after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。 Note: ##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

3.2 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織含水量的影響

與正常對照組相比，缺氧模型組小鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.01)，經薺苧黃酮和蘆丁干預后，腦組織含水量較缺氧模型組顯著降低(P<0.01或P<0.05)。結果見圖2。

3.3 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中ROS和MDA含量的影響

缺氧模型組小鼠腦組織中ROS和MDA含量較正常對照組顯著升高(P<0.01)，經薺苧黃酮和蘆丁預處理可以顯著降低ROS和MDA水平(P<0.01)。結果見圖3。

圖3 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中ROS和MDA含量的影響Fig.3 Effects of mosloflavone on the content of ROS and MDA in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，**P<0.01。 Note: ##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group.

3.4 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中抗氧化體系的影響

缺氧模型組小鼠腦組織中GSH含量和SOD、CAT和GSH-Px活性較正常對照組顯著下降(P<0.01)，經薺苧黃酮和蘆丁預處理可以顯著提高GSH含量(P<0.01)和SOD、CAT和GSH-P的活力(P<0.01)。結果見圖4。

圖4 薺苧黃酮對高原缺氧小鼠腦組織中GSH、SOD、CAT和GSH-Px的水平的影響Fig.4 Effects of mosloflavone on the level of GSH,SOD,CAT and GSH-Px in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。 Note:##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

3.5 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織炎性因子含量的影響

缺氧模型組與正常對照組相比，小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著升高(P<0.01)；經薺苧黃酮和蘆丁預處理能夠逆轉這種變化，降低促炎性因子的水平。結果見表2。

表2 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α和IL-6含量的影響

3.6 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中SOD1和CAT蛋白表達的影響

與正常對照組相比，缺氧模型組SOD1和CAT的蛋白表達顯著降低(P<0.01)，經蘆丁和薺苧黃酮預處理可以顯著升高缺氧小鼠腦組織中SOD1和CAT的蛋白表達(P<0.01)。結果見圖5。

圖5 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中SOD1和CAT蛋白表達的影響Fig.5 Effects of mosloflavone on the expression of SOD1 and CAT in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，**P<0.01。 Note:##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group.

3.7 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達的影響

與正常對照組比較，缺氧模型組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白的表達顯著升高(P<0.01)；經蘆丁和薺苧黃酮預處理可顯著降低腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)。結果見圖6。

圖6 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達的影響Fig.6 Effects of mosloflavone on the expression of IL-1β and TNF-α in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，**P<0.01。 Note:##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group.

4 討論與結論

暴露于以低壓低氧為特征的高原環境是一種極端的生理應激狀態，對機體多個臟器都會造成有害影響。其中，大腦由于耗氧量巨大，是對高原缺氧最為敏感的器官之一。先前的研究指出，低壓低氧誘發的氧化應激是導致腦組織損傷的因素之一[13]。體內外實驗表明，低壓低氧能夠誘導細胞和組織中ROS的蓄積[10]。過量的ROS能夠攻擊腦組織中含量豐富的不飽和脂肪酸和生物大分子，誘發脂質過氧化，使MDA含量顯著升高[3]。這與我們的實驗結果相一致：缺氧模型組小鼠腦組織中ROS和MDA含量較正常對照組顯著升高，而給予薺苧黃酮預處理能夠顯著降低腦組織中ROS和MDA的水平。以上結果說明薺苧黃酮可以顯著抑制低壓低氧誘導的氧化應激和脂質過氧化。

正常生理條件下，ROS不斷生成并被體內的抗氧化酶和非酶抗氧化體系清除并維持在較低的水平。SOD、CAT和GSH-Px是細胞內重要的抗氧化酶。SOD將超氧陰離子轉化為氧氣和過氧化氫，CAT將過氧化氫轉化為水和氧氣，而GSH-px將脂質過氧化物還原為它們相應的醇類，并將游離的過氧化氫還原成水[14]。GSH是細胞內關鍵的非酶抗氧化劑，能夠通過直接清除自由基從而保護生物大分子免受自由基的攻擊，同時GSH-px還利用GSH作為電子供體，將其轉化為谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，后者又被谷胱甘肽還原酶(GSSG-red)再生為GSH[15]。低壓低氧誘導ROS大量產生的同時，還會破壞抗氧化體系，進而加劇氧化應激損傷[13]。在本研究中，急性低壓低氧導致小鼠腦組織中GSH水平以及SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低，而薺苧黃酮能夠提高GSH的含量，維持抗氧化酶的活性。同時研究還發現，急性低壓低氧能夠導致小鼠腦組織中SOD1和CAT蛋白表達顯著下降，經薺苧黃酮預處理能夠顯著提高兩個抗氧化蛋白的水平，改善腦組織的氧化應激失衡。

氧化應激和炎癥是相互依存，相互關聯的過程。一方面，炎性細胞在炎癥部位釋放大量的ROS，導致過度的氧化損傷。另一方面，許多ROS和氧化應激產物能夠增強炎性反應[16]。近年來研究發現，炎癥反應在高原缺氧損傷中具有非常重要的作用。Hartmann等[17]研究發現：健康志愿者在高海拔(>3 400 m)環境暴露三天，血液中IL-1和IL-6等炎癥細胞因子水平顯著升高。Song等[18]研究表明：人體內TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性因子水平與急性高山病(AMS)的癥狀呈正相關。這些促炎性因子能夠誘導小膠質細胞活化，導致其它炎性介質的釋放并導致炎癥級聯反應[19]。炎性介質可以通過刺激花生四烯酸的代謝使自由基釋放增加，加重氧化應激損傷，通過增加水通道蛋白及其下游靶基因的表達，損傷腦微血管基膜、增加血管通透性、破壞血腦屏障進而造成血管原性腦水腫，加重腦組織損傷。我們的研究結果也顯示：低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎性因子水平顯著增加，Western bolt實驗進一步證明，低壓低氧能夠顯著上調小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白水平，給予薺苧黃酮預處理能夠降低腦組織中促炎性因子含量，下調TNF-α和IL-1β蛋白水平。以上結果表明：薺苧黃酮對低壓低氧誘導腦組織損傷的保護作用可能與其介導炎性因子的表達相關。

綜上所述，薺苧黃酮對高原缺氧小鼠腦組織的保護作用機制與其清除過量自由基，緩解機體氧化應激，抑制炎性反應有關。