乳酸菌分離鑒定及其條斑紫菜乳酸局混合發酵理化因子的變化

王雪寧 朱新迎 成群

摘要：對泡菜老壇水中的乳酸菌進行分離鑒定，獲得3株乳酸菌，確定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。以條斑紫菜（Porphyra yezoensis）為原料，以4種不同配比的上述乳酸菌對條斑紫菜進行直投式發酵，探討發酵過程中發酵液部分理化因子的變化規律。結果顯示，4種發酵液的pH下降趨勢相似，從開始的4.51下降到2.90;1∶1∶2（體積比）混合乳酸菌發酵液的產酸能力最強，發酵終點總酸含量為13.75 g/L，為發酵開始的6倍;1∶1∶2混合乳酸菌發酵液的總糖含量由開始的29.95 g/L下降為發酵終點的18.97 g/L;1∶1∶2混合乳酸菌發酵液亞硝酸鹽含量的峰值最小，為3.75 mg/kg;1∶1∶1混合乳酸菌發酵液氨基酸含量較高，最大值為58.16 μmol/mL;蛋白質含量下降幅度最大的是1∶1∶3混合乳酸菌發酵液。

關鍵詞：乳酸菌;分離鑒定;條斑紫菜（Porphyra yezoensis）;發酵;理化因子

中圖分類號：S188 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）10-0139-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.033 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Three strains of lactobacillus were isolated and identified from fermented liquid of pickle after isolation and identification. They were identified as Lactobacillus brevis， Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei. Then these lactic acid bacteria were used to directly ferment Pyropia yezoensis with four different ratios， and some physical and chemical changes in the fermentation process was discussed. The results showed that all four kind of mixed lactobacillus fermentation broth had similar pH decline trends， from 4.51 to 2.90; 1∶1∶2 （V∶V∶V） mixed lactobacillus fermentation broth had the strongest acid production capacity， and at the end point of fermentation， the total acid content was 13.75 g/L， which was 6 times of the beginning; the total sugar content of 1∶1∶2 mixed lactobacillus fermentation broth was from the initial 29.95 g/L to 18.97 g/L at the fermentation end point; the minimum peak of nitrite content of 1∶1∶2 mixed lactobacillus fermentation broth was 3.75 mg/kg; the higher amino acid content occurred in 1∶1∶1 mixed lactobacillus fermentation broth， with the maximum value of 58.16 μmol/mL; the 1∶1∶3 mixed lactobacillus fermentation broth had the largest decrease of protein content.

Key words： lactobacillus; isolation and identification; Porphyra yezoensis; fermentation; physical and chemical factors

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）屬紅藻綱紅毛草科，是最常見的一種食用海藻，富含蛋白質及氨基酸，還含有鈣、鐵、磷等微量元素，具有特殊的揮發性風味物質，既可食用也可藥用[1-3]。因為紫菜具有很好的營養價值，所以常在食品加工業中作為一類重要的原材料。紫菜產業是國內具有經濟價值的海產養殖業之一，其中連云港市作為全國紫菜的兩大生產基地之一，產量占全國的60%以上，養殖業迅速擴大，紫菜產量劇增，但紫菜的深加工產品比較單一，沒有達到很好的經濟效益[4]。目前，對于紫菜的研究方向大多集中在紫菜醬及紫菜功能成分的提取等方面[5，6]。

乳酸菌指一類具有兼性厭氧的、不產芽孢的，可利用糖類化合物進行反應，生成乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱。乳酸菌具有豐富的生物多樣性，被廣泛應用在食品行業、醫藥保健行業等領域。泡菜是指隔絕空氣后在低濃度鹽水腌制條件下，其本身帶有微生物或人工添加乳酸菌作為發酵劑，發酵蔬菜產生大量乳酸的一類傳統蔬菜發酵類食品。發酵過程產生的乳酸等風味物質，除了改善食品的風味、提高蔬菜營養價值外，還可以抑制其他腐敗菌的生長代謝活動[7]。乳酸菌還有助于改善人體腸道菌群，提高消化能力，減輕便秘，降低膽固醇[8]。

本研究從泡菜老壇水中分離乳酸菌， 利用16S rRNA分子生物學檢測的方法對其進行初步鑒定。以分離鑒定的乳酸菌形成不同配比，將其作為發酵劑，對紫菜進行直投式發酵，探討不同配比乳酸菌發酵劑對條斑紫菜混合發酵過程中理化因子的變化，以期為紫菜加工業提供理論依據并提高紫菜相關產業的經濟效益。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

泡菜老壇水、條斑紫菜：市場購買;總氨基酸（A026-1-1）、總蛋白質（A045-2）、亞硝酸鹽（A038）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;其他化學試劑均為分析純。

改良乳酸菌培養基：酵母膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，葡萄糖10 g，KH2PO4 ?2 g，番茄汁100 mL，吐溫80 0.5 mL，去離子水900 mL，調pH 7.0（固體培養基添加瓊脂10 g/L），121 ℃滅菌15 min。MRS培養基：葡萄糖20 g ，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨5 g，磷酸氫二鉀2 g，三水乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL（瓊脂15～17 g），去離子水1 000 mL。

兩種培養基調pH為 6.5，0.07 MPa（115 ℃）滅菌20 min備用。

1.2 ?儀器與設備

ReadMax 1900 Plus光吸收型全波長酶標儀（上海閃譜科技有限公司）;T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;SevenEasy實驗室pH計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）]。

1.3 ?方法

1.3.1 ?乳酸菌分離鑒定 ?取 100 μL老壇水和900 μL無菌水到1.5 mL離心管中振蕩混勻作為10-1稀釋液，以10倍稀釋法對其進行梯度稀釋到10-6。吸取100 μL 10-4、10-5和10-6稀釋液涂布至滅菌的改良固體培養基上，每個梯度3個平板，在37 ℃條件下培養48 h，然后挑取具有典型乳酸菌菌落特征的菌株進行平板劃線分離純化。將分離純化后的單菌落接種到5 mL的MRS液體培養基中，37 ℃條件下振蕩培養48 h。收集菌液送上海派森諾生物科技公司進行菌種鑒定。

1.3.2 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵 ?選取經鑒定后的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）進行不同比例的紫菜乳酸菌混合發酵，設計的比例為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3（OD550 nm調成一致條件下的體積比）以及干酪乳桿菌單菌發酵。準備12個玻璃發酵瓶，每個發酵瓶中稱取10 g左右的干紫菜，無菌水200 mL，食鹽添加量1 g，葡萄糖6 g，置于高壓滅菌鍋（105 ℃、20 min）滅菌后，在超凈臺中完成菌液的接種，菌種接種量為5%，密封后放入25 ℃生化培養箱中發酵，設置3個平行。每天對紫菜發酵液進行理化指標的檢測，連續7 d，取樣需無菌操作。

1.3.3 ?理化指標檢測 ?pH測定用pH計;總酸的檢測采用GB/T 12456―2008食品總酸檢測方法[9];發酵液的亞硝酸鹽、氨基酸、蛋白質含量的檢測均按試劑盒的說明書操作;總糖含量的測定采用蒽酮比色法[10]。

2 ?結果與分析

2.1 ?乳酸菌分離鑒定

按“1.3.1”的方法獲得3株乳酸菌，命名為HYR-1、HYR-4、HYR-9，經初步鑒定HYR-1為短乳桿菌、HYR-4為植物乳桿菌、HYR-9為干酪乳桿菌。圖1顯示的是3株菌16S rRNA經序列比對后采用MEGA6軟件鄰接法構建的系統進化樹。

2.2 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵液pH的變化

條斑紫菜乳酸菌混合發酵液pH的變化與發酵時間的關系如圖2所示，發酵液的起始pH均在4.50左右，隨著發酵時間的延長，乳酸菌混合發酵過程中pH整體呈下降趨勢，在發酵1～2 d，pH下降速度很快，之后速度減緩，在發酵至5 d時，4種不同配比發酵液pH基本穩定且維持在2.90～3.05，不同配比的條斑紫菜乳酸菌混合發酵液在pH的變化上沒有明顯區別，表明乳酸菌發酵紫菜在發酵5 d時就已經達到發酵終點，大大縮短了發酵周期。這與成群等[11]研究乳酸菌制劑發酵泡菜過程中pH的變化趨勢一致。

2.3 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵液總酸含量的變化

由圖3可知，4種不同比例乳酸菌混合發酵條斑紫菜過程中總酸含量的整體變化趨勢相似，紫菜發酵過程中發酵液的總酸含量逐漸增加。發酵2 d總酸含量增長速度最快，之后增長速度減緩，到發酵5 d時總酸含量變化趨于平緩，從發酵開始總酸含量為2.30～3.52 g/L，到發酵終點總酸含量為12.96～13.75 g/L，1∶1∶2條斑紫菜乳酸菌混合發酵液產酸能力最強，發酵7 d總酸含量為13.75 g/L，為發酵開始時的6倍。單菌發酵開始總酸含量最高，到達發酵終點總酸含量反而最低，含量為12.96 g/L。表明乳酸菌混合發酵比單菌發酵的產酸能力略強。

2.4 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵液總糖含量的變化

利用蒽酮比色法測得總糖標準曲線方程為y=6.379 1x+0.005 8，通過該方程計算條斑紫菜乳酸菌混合發酵液中的總糖含量。如圖4所示，4種不同配比條斑紫菜乳酸菌混合發酵液的總糖含量逐漸降低，在發酵2 d時，總糖含量的降低速度最快，主要由于此時各類乳酸菌生長繁殖需要大量的碳源，因此利用發酵液中的糖分（主要為單糖和少量多糖）產生大量的乳酸及其他代謝產物。其中，1∶1∶2條斑紫菜乳酸菌混合發酵液的總糖含量由最開始的0.417 3 g/L到發酵終點0.284 0 g/L，發酵過程中消耗可溶性總糖量最大，利用率達到32.94%。1∶1∶1混合乳酸菌發酵過程中總糖含量在5 d時有升高的跡象，有可能是此時乳酸菌生長速度減緩，條斑紫菜中部分多糖類物質被分解到發酵液中的速度大于乳酸菌消耗可溶性總糖的速度[12]。從圖4中還可以發現，單菌發酵分解可溶性糖類的能力比混合乳酸菌發酵能力弱。

2.5 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵液亞硝酸鹽含量的變化

條斑紫菜乳酸菌混合發酵液的亞硝酸鹽含量與發酵時間的關系見圖5。在發酵初期，4種發酵液中的亞硝酸鹽含量的變化趨勢均為先增加達到峰值之后再降低。4種發酵液的亞硝酸鹽含量峰值均在2 d時出現，之后逐漸下降，最后在6～7 d時趨于平穩，且亞硝酸鹽的含量均低于國家限量標準（20 mg/kg）。亞硝酸鹽含量到達峰值后下降是由于各類乳酸菌大量繁殖后，產生大量乳酸等代謝產物，亞硝酸鹽在酸性條件下不穩定，逐漸分解。同時，由于發酵過程中的氧氣消耗殆盡，硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽的能力也逐漸降低。3種混合發酵液亞硝酸鹽含量的峰值分別為3.91、3.75、3.84 mg/kg，而單菌發酵液的峰值為4.43 mg/kg，這可能由于單菌發酵產生的乳酸含量低于混合發酵的產酸量，酸解亞硝酸的能力也相對弱一些。1∶1∶2、1∶1∶3混合發酵液和單菌發酵液在發酵終點時亞硝酸鹽含量降至最低， 約為0.25 mg/kg，而1∶1∶1混合發酵液在6 d時亞硝酸鹽含量有略微升高趨勢，最終為0.86 mg/kg，原因可能是在頻繁取樣過程中帶入氧氣或雜菌導致[13]。

2.6 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵液總氨基酸含量的變化

條斑紫菜乳酸菌混合發酵液總氨基酸含量與發酵時間的關系見圖6。4種不同配比乳酸菌發酵的發酵液中的氨基酸含量都是先增加后降低。發酵前期由于條斑紫菜中的蛋白質在乳酸菌的作用下，通過各種代謝途徑降解為小分子肽和游離的氨基酸，以及條斑紫菜本身的呈味氨基酸不斷溶入發酵液中，使得發酵液中的氨基酸含量呈快速增加狀態。發酵后期，由于部分氨基酸被乳酸菌利用導致氨基酸含量下降，隨著乳酸菌的代謝活動減慢，氨基酸含量也趨于穩定。1∶1∶3混合發酵液在發酵3 d時達到最大值，其他3種發酵液均在發酵2 d就達到最大值。其中，1∶1∶1混合發酵液發酵過程中氨基酸含量較高，最大值為58.16 μmol/mL，其他發酵液均在51.00 μmol/mL左右。這可能是由于1∶1∶1混合發酵液中短乳桿菌生長較好，對氨基酸含量的升高起積極作用，這與宋佳錕等[14]的試驗結論相似。

2.7 ?條斑紫菜乳酸菌混合發酵液總蛋白質含量的變化

由圖7可知，隨著發酵時間的增加，發酵液中蛋白質含量先呈快速上升趨勢，到達最大值后呈緩慢下降趨勢，到發酵后期趨于平穩。在發酵2 d時發酵液中蛋白質含量達到最大值，此時單菌發酵的蛋白質含量最低，為2.42g /L，1∶1∶3混合發酵液中蛋白質含量最高，為4.32g /L，是單菌發酵的1.79倍。在發酵初期，在乳酸菌的發酵作用中，條斑紫菜中的蛋白質被不斷釋放到發酵液中，使得發酵液中的蛋白質含量快速增長，由于乳酸菌生長代謝利用發酵液中的蛋白質分解為氨基酸，使得發酵液中的蛋白質含量逐漸下降[15]。隨著代謝活動減緩，發酵時間的延長，發酵液中蛋白質的含量也趨于平穩， 其中3種乳酸菌混合發酵到達終點時蛋白質含量在2.29～2.50g /L，而單菌發酵中蛋白質的含量為1.87 /L。從圖7中可發現，蛋白質含量下降幅度最小的是單菌發酵，下降幅度最大的是1∶1∶3混合發酵液，說明復合菌利用蛋白質的能力比單菌發酵利用蛋白質的能力強。

3 ? 結論

本試驗利用16S rRNA序列比對法對老壇水中的乳酸菌進行分離鑒定，得到3株菌，初步確定為短乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌。以分離鑒定的乳酸菌形成不同配比，將其作為發酵劑對條斑紫菜進行直投式發酵，比例分別為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3及單菌。通過對4種不同乳酸菌發酵制劑發酵條斑紫菜過程中理化因子的變化規律進行研究，探索出單菌發酵和復合發酵對條斑紫菜發酵的影響。

對4種發酵液中的pH進行檢測，結果發現4種發酵液的pH整體下降趨勢相似，發酵2 d由于乳酸菌處于對數生長期，生長代謝最旺盛，發酵液pH迅速下降，到發酵5 d時呈平穩狀態，4種發酵液的pH均從發酵前的4.50左右下降到2.90左右，這與于新穎等[12]測量的泡菜鹵中pH的變化趨勢相似。對總酸的檢測中發現，總酸含量在發酵前3 d增加速度最快，并在發酵5 d后逐漸趨于平穩，從發酵開始的總酸含量為2.30～3.52 g/L，到發酵后期總酸含量為13.00～13.75 g/L，對比發現3種復合菌發酵比單菌發酵的產酸能力略強[16]。4種不同比例乳酸菌發酵條斑紫菜發酵液的總糖含量逐漸降低，其中1∶1∶2乳酸菌混合發酵的總糖含量由最開始的29.95 g/L下降到發酵終點的18.97 g/L，發酵過程中消耗可溶性總糖量最大。單菌發酵分解可溶性糖類的能力比乳酸菌混合發酵分解糖類的能力弱。在發酵初期，4種發酵液中亞硝酸鹽的含量的變化趨勢均為先增加達到峰值之后再降低[17-20]。4種發酵液發酵過程中亞硝酸鹽峰值出現時間相同，但峰值大小不同，其中1∶1∶2混合發酵液的峰值最低，為3.75 mg/kg;單菌發酵的峰值最高，為4.43 mg/kg。發酵過程中發酵液的總氨基酸含量都是先增加后降低，其中1∶1∶1混合發酵液發酵過程中的總氨基酸含量較高，最大值為58.16 μmol/mL，其他處理均在51.00 μmol/mL左右。發酵液中的總蛋白質含量先呈快速上升趨勢，發酵2 d達到最大值后呈緩慢下降趨勢，到發酵5 d趨于平穩，其中總蛋白質含量下降幅度相對較小的是單菌發酵液，下降幅度相對較大的是1∶1∶3混合發酵液，說明混合發酵利用蛋白質的能力比單菌發酵利用蛋白質的能力強。

對從老壇水中分離并鑒定的純種乳酸菌進行發酵試驗，可以大大縮短條斑紫菜的發酵周期，發酵5 d進入平穩期，這是由于接種2 d后的乳酸菌處于對數增長期，繁殖能力旺盛，產酸能力強，產亞硝酸鹽含量低，利用蛋白質和氨基酸能力強，這與趙文紅等[21]的研究結果一致。4種乳酸菌發酵條斑紫菜的過程中，混合乳酸菌發酵比單菌發酵具有優勢，其中1∶1∶2混合發酵液發酵效果最好。但由于條斑紫菜前期經過殺菌處理，排除了其他微生物的協同作用，所以風味方面還需要進一步研究。