外源性碳氮添加對北方半干旱草原土壤有機質礦化的影響

田玉強，陳穎，歐陽勝男，孫悅

1.北京師范大學地表過程與資源生態國家重點實驗室/自然資源學院/地理科學學部，北京 100875；2.德國哥廷根大學農業土壤科學系，德國 哥廷根 37077

在全球變暖和大氣N沉降增加的背景下，溫度上升導致的植被生產提高而向地下C輸入的增加，以及N沉降增加導致的土壤可利用N含量增加對陸地生態系統C排放的潛在影響仍存在爭議。中緯度半干旱草原是全球陸地生態系統的主要類型，中國北方溫帶半干旱典型草原生態系統約占全國草原面積的10.5%（郝彥賓等，2006）。該生態系統儲藏了大量SOC，這部分C對溫度升高和土壤可利用N含量增加產生的響應可能會對局地氣候變化產生深遠影響（孫悅等，2014），故迫切需要對此進行深入探析。凋落物和根系分泌物的輸入是自然草地生態系統SOM的主要來源，這些外源物質的輸入必然會對草原土壤的物質循環和能量流動產生潛在影響。

雖然國內外很多學者已經就外源物添加對SOM礦化影響進行了很多研究，但結論仍存在很大的不確定性。向沙丘草地土壤中添加凋落物的化學成分中，極易分解的有機物顯著促進了土壤的C礦化過程（楊紅玲等，2019）；向土壤中單獨添加 C對土壤微生物產生激活作用，從而促進了SOM的分解（Chen et al.，2014；Fontaine et al.，2011），同時添加蔗糖和 N極大促進了微生物生長從而加速原有土壤的C礦化過程（Chen et al.，2014）；而陳曉鵬（2013）的研究表明外源性C添加顯著增加了土壤C排放，但是C-N添加并未顯著促進SOM分解；此外，C、N的添加水平影響著SOM的分解，其中在較低濃度的C添加實驗中可以觀測到土壤C排放的顯著增加（Blagodatskaya et al.，2007）。隨著同位素技術的興起，土壤激發效應的研究也逐漸增多（陳春梅等，2006；黃文昭等，2007）。各種有機物質的添加引起的土壤原有SOM周轉強烈的短期改變，被稱為土壤的激發效應（Kuzyakov et al.，2000），激發效應可以通過影響土壤微生物活動而影響土壤有機C礦化，甚至進一步影響全球變暖進程（龐蕊等，2017）。在草地生態系統土壤中它通常是由凋落物分解與根系分泌物輸入分解引起，而大氣N沉降增加可能會影響外源性C輸入誘發的土壤激發效應的強度和方向，從而影響原有 SOC庫大小。

為了進一步探究全球變暖和大氣 N沉降對草原生態系統原有SOM礦化的潛在影響，盡量減少野外實驗中溫度和水分變化等因素對研究結果的不可控影響，控溫控濕的室內模擬培養實驗則是一種相對比較有效和合理的研究手段?；诖?，本研究通過室內模擬不同外源物質添加對土壤原有SOM礦化的影響，明晰半干旱草原土壤在生長季最適溫度與水分充足條件下SOM的最大礦化潛力。該研究對我們更好的深入理解半干旱草原土壤C循環對全球變化的響應及其適應機理有著重要意義，可為北方半干旱草原牧草生產以及養分管理提供實驗數據與理論支撐。

1 研究地區自然概況

研究區位于北方半干旱草原區，北京師范大學內蒙古錫盟太仆寺旗試驗站圍封樣地內（41°35′50″N，114°51′45″E）。該區域屬中溫帶半干旱大陸性氣候，夏季溫暖濕潤，冬季寒冷干燥，近年來氣候變化呈現暖干化趨勢（史培軍等，2014）。研究區屬于內蒙古克氏針茅-羊草草原（龔容等，2016），主要植被優勢種（徐粒等，2014）為克氏針茅（Stipa krylovii）、羊草（Leymus chinensis）、糙隱子草（Cleistongens squarrosa）、冷蒿（Artemisia frigida）。植物生長季為5—9月，最熱月為7月，平均氣溫為 21 ℃。近 35年平均降雨量為 384.5 mm，降水主要集中在6—8月。土壤類型為栗鈣土（龔容等，2016），有機質含量較低，主要的土壤理化性質見表1。

表1 土壤主要理化性質Table 1 The physic-chemical characteristics of upper 15 cm soil in the semi-arid grassland of North China

2 研究方法

2.1 實驗設計

本研究以13C標記葡萄糖（G）為C源，以銨態氮（(NH4)2SO4）或硝態氮（KNO3）為N源。分單獨添加和組合添加共 6種處理：單獨添加 C源（G），AM，NT；組合添加碳G和AM (G+AM)，碳和NT (G+NT)，以及不添加外源物質作為空白對照（CK）。每種處理3個重復（n=3）。本實驗采用C、N添加量與實測土壤微生物量C、N相當（陳曉鵬，2013），對土壤微生物活動擾動較小，所以分別參考 SOC和 TN的 2%進行 C、N添加（Blagodatskaya et al.，2008；Qiao et al.，2014；Qiao et al.，2019）。同時參考研究區域草原植物生長季的多年均溫（徐粒等，2014）（21 ℃）作為土壤培養溫度，以田間持水量70%作為土壤含水量的添加依據。

本研究所采用的培養土壤2013年7月采集于北京師范大學內蒙古太仆寺旗試驗站圍封樣地，經過風干后過2 mm篩保存。2014年4月29日開始培養實驗：分別稱取30 g風干土壤裝入250 mL培養瓶，室溫下預培養8 d以活化恢復土壤微生物的活性。預培養實驗結束后立即添加13C標記C以及N，同時將裝有5 mL 1.0 mol?L-1NaOH堿液的小塑料瓶分別迅速放入培養瓶并密封，最后將所有培養瓶放入培養箱（設置培養溫度為 21 ℃）進行正式培養實驗。正式培養實驗開始后的第 4、7、11天分別收獲所有培養瓶中裝有堿液的小塑料瓶，同時迅速放入另1批裝有相同數量堿液的小塑料瓶，第18天收獲最后1批裝有堿液小塑料瓶。每批堿液小塑料瓶取出后迅速擰緊瓶蓋，用以測定堿液吸收CO2與13C的量。

2.2 測定方法

SOM 礦化 C-CO2釋放量的測定：酸堿滴定法（白潔冰等，2011）。

從收集的裝有堿液小塑料瓶中吸取1 mL堿液吸收液，加入1 mL 0.5 mol?L-1BaCl2，再加入1—2滴酚酞和2 mL蒸餾水，充分混勻后用0.2 mol?L-1的標準鹽酸滴定至無色，計算得到堿液吸收的C-CO2量。

SOM礦化13C-CO2釋放量的測定：Mat253同位素質譜儀。

從收集的裝有堿液小塑料瓶中吸取1 mL堿液吸收液，加入4 mL 0.5 mol?L-1的SrCl2形成SrCO3沉淀。將沉淀物用蒸餾水洗滌3次，烘干測定δ13C。

SOC的測定：重鉻酸鉀-外加熱法（鮑士旦，1999）。

TN的測定：凱氏定N法（鮑士旦，1999）30-44。

土壤銨態氮和硝態氮：土壤經K2SO4浸提，用SEAL-AA3連續流動分析儀（德國）測定。

將稱取的10.0 g土壤加入40 mL 0.05 mol?L-1K2SO4搖床振蕩 1 h（150 r?min-1），靜置 20 min 過濾得到土壤浸提液，最后用SEAL-AA3連續流動分析儀測定。

2.3 數據計算

SOM 礦化 C-CO2釋放量Cmin（μg?g-1）計算公式如下（白潔冰等，2011）：

其中，V0和V分別為空白標定和樣品滴定時消耗的標準鹽酸體積（mL），CHCl為標準鹽酸濃度（0.2 mol?L-1），m為每個培養瓶中培養土壤質量（30 g），ω為土壤含水量（%）。

SOM礦化累積C-CO2釋放量Cn（μ?g-1）的計算：

其中，n表示第n次收集堿液（n為1，2，3，4）。Cmin1，Cmin2，Cmin3，Cmin4分別表示標記開始后培養的前4 d，第5—7天，第8—11天以及第12—18天的SOM礦化釋放的C-CO2量。

外源性物質輸入會加速或抑制SOM的分解，該過程被稱為土壤激發效應 PE（Priming effect）（μg?g-1），計算公式如下（Hamer et al.，2005；Kuzyakov et al.，2006）：

其中，Ct表示添加外源物質（G；G+AM；G+NT）后SOM礦化累積C-CO2釋放量減去13C標記物的礦化累積13C-CO2釋放量（μg?g-1），CC表示沒添加外源有機物的土壤礦化累積C-CO2釋放量（即在G、G+AM、G+NT處理下，CC分別為CK、AM、NT）（μg?g-1）。

土壤激發效應指數（PI）表征激發效應發生的強度（Shen et al.，1996）：

其中，PE為土壤激發效應（μg?g-1），CC表示未添加外源有機物的土壤礦化累積 C-CO2釋放量（即在G、G+AM、G+NT處理下，CC分別為CK、AM、NT）（μg?g-1）。如果外源物添加沒有引起 SOM礦化量變化，則PI=1；如果PI＞1，則外源物的添加會引起SOM礦化的激發效應，且數值越大，這種激發效應越強；若PI＜1，則外源物質的添加會降低SOM 的礦化作用，產生負激發效應，PI越小，負激發效應越強。

同時添加C源和N源對SOM礦化量影響的疊加效應AE（Additive effect）的計算公式如下（呂殿青等，2007）：

其中，CC-N表示同時添加C、N（G+AM；G+NT）的土壤礦化累積 C-CO2釋放量（μg?g-1），CCK表示未添加任何外源物質的空白對照的土壤礦化累積C-CO2釋放量（μg?g-1），CG表示只加葡萄糖（G）的土壤礦化累積 C-CO2釋放量（μg?g-1），CN表示只添加 N（AM或NT）的土壤礦化累積 C-CO2釋放量（μg?g-1）。AE＞1為正疊加效應；AE＜1為負疊加效應。

2.4 數據處理與統計分析

運用Excel 2016和SPSS 20進行相關的數據計算和統計分析，作圖使用SigmaPlot 12。不同處理（外源添加物）間累積 C-CO2釋放量的顯著性差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），外加C源和N源對SOM礦化的疊加效應隨時間的變化采用重復測量方差分析（Repeated measurement ANOVA）。多重比較的顯著性檢驗選擇Tukey HSD法，顯著性水平為P=0.05。

3 結果與分析

3.1 外加碳源（葡萄糖）對土壤有機質礦化量的影響

圖1 添加C源對SOM礦化量的影響Fig.1 The effects of 13C-glucose addition on SOM mineralization

外源C添加后土壤原有SOM礦化C量顯著大于未添加對照（圖1）。推測其原因是添加葡萄糖對原有SOM礦化產生了激發效應的影響。添加葡萄糖到土壤培養后的第4天，土壤原SOM分解釋放出來的礦化C是未添加土壤釋放的2.04倍，存在顯著差異（F=28.17，P＜0.05）。之后隨著土壤培養時間的延長，比值逐漸變小，說明激發效應的程度隨著時間的延長而減弱，平均激發強度為 (1.62±0.26)倍。在培養后的18 d，土壤中釋放出來的礦化C是未添加的 1.43倍（圖 1）。這種累積礦化量的改變可能與外源C添加后土壤微生物群落結構的改變相關（單文俊等，2016）。

3.2 外加氮源對土壤有機質礦化量的影響

外加不同N源（AM和NT）使得原有SOM分解礦化C量小于未添加外源N處理（圖2）。添加AM和NT土壤礦化C量分別為未添加N源處理土壤的82%和77%，可能的解釋是由于N素添加相對抑制了土壤原有機質的礦化分解，即增加了原有C的固持。但是這兩種外源N添加后在不同的培養時間段內土壤礦化 C釋放累積量之間沒有顯著差異（P＞0.05）（表2）。由此我們可以推斷添加外源N對取樣地區的土壤礦化C的釋放具有抑制效應。

圖2 添加N源對SOM礦化量的影響Fig.2 The effects of nitrate or ammonia addition on SOM mineralization

表2 添加C源和N源的重復測量方差分析Table 2 ANOVA analysis within- and between- subjects effects of C and N addition

3.3 外加碳源和氮源對土壤有機質礦化的影響

圖3 添加C源和N源對SOM礦化C量的影響Fig.3 The effects of adding glucose and N sources on SOM mineralization

同時加入C源和N源，土壤原有機質的礦化量明顯大于未添加外源物質的土壤（圖3）。且在培養的整個時間段內，添加葡萄糖和 KNO3的 C礦化＞添加葡萄糖和(NH4)2SO4的 C礦化量＞未添加外源物質的土壤的有機碳礦化量，用組間效應方差分析方法，兩種添加基質的C礦化量有顯著差異（P＜0.05）。而且通過計算發現，在培養的第4天，這種激發效應的強度最大（G+NT，3.13；G+AM，2.60），在培養的18 d時間里，G+NT和G+AM 平均激發效應強度分別為 (2.40±0.31)和(1.97±0.14)。

3.4 外加碳源和氮源對土壤有機質礦化的疊加效應

疊加效應是指C源和N源同時添加所引起的激發效應的強度大于單獨施加C源對SOM的礦化產生正激發效應程度（圖1和圖3）。表3表示添加C源和N源對C礦化的疊加效應大小，可以看出，葡萄糖和 KNO3的疊加效應要明顯大于葡萄糖和（NH4)2SO4。且在培養的前11 d內，這種疊加效應的差異值達到最大。

表3 添加C源和N源對SOM礦化的疊加效應Table 3 Additive effect with the C and N addition on the mineralization of SOM

4 討論

4.1 外加碳源對土壤碳礦化的影響

SOM的礦化受SOM含量、溫度、土壤含水量以及N可利用性等諸多因素的影響（Cheng et al.，2005；Hamer et al.，2005；Zhang et al.，2013），尤其是外源有機質輸入的種類和量的多少會直接影響到微生物及其分泌酶的過程（Li et al.，2018；魏圓云等，2019），長期添加混合有機質還會改變土壤本身的SOM含量和聚合結構（Lin et al.，2019），從而影響SOM的礦化過程。甚至有研究表明活性C源的添加比增溫更顯著的刺激了土壤微生物及相關酶的活性，極大地促進了SOM的短期周轉（Wei et al.，2019；袁淑芬等，2015）。多項研究表明外加葡萄糖能產生正激發效應（廖暢等，2016；呂殿青等，2007；袁淑芬等，2015），本研究的結果也發現，單獨外加葡萄糖對土壤原有有機質的礦化產生正激發效應（圖4）。但Dalenberg et al.（1989）的研究結果發現添加葡萄糖后不產生正激發效應。激發效應的產生與土壤微生物對添加基質的響應密不可分（Fontaine et al.，2011）。葡萄糖是一種易被微生物分解吸收能量的有機質。通常情況下，外加新鮮有機質能夠促進休眠狀態下多種類微生物的活性被激發，這些被激活的微生物通過代謝和提高胞外酶的產量從而提高對SOM的降解，產生正激發效應。產生負激發效應是由于激發釋放的C量主要來自微生物的新陳代謝，也有學者認為微生物放棄難分解的 SOC而轉向容易分解的外源有機碳是負激發效應產生的另一機理（Kuzyakov et al.，2006）。內蒙古半干旱地區土壤相對貧瘠，C含量限制了微生物生長所需的能量來源，從而限制了SOM的礦化，當加入易被微生物利用的C源時，新加入的有機碳能為微生物提供能量和營養元素，提高了微生物活性，促進SOM分解產生正激發效應。Chen et al.（2014）研究認為激發效應和微生物群落結構緊密相關。將微生物群落依據競爭養分的情形分為r對策和K對策兩種類型（Blagodatskaya et al.，2007），r對策微生物群落表示在不受營養條件限制下微生物擁有最大種群增長率的群落，K對策微生物表示能更有效利用資源，并且生長緩慢的微生物群落。廖暢等（2016）的研究也表明葡萄糖添加顯著降低了r對策微生物比例而K對策微生物相對增加。在單獨外加C源的條件下，對N受限的生態系統，K對策微生物是促進正激發效應產生的主要因素。

圖4 外加C源和N源對SOM礦化激發效應的影響Fig.4 The priming effects of C and N addition on SOM mineralization

4.2 外加氮源對土壤碳礦化的影響

外源N素的輸入對草原土壤微生物數量、生物量、呼吸和多樣性產生一定的影響（何亞婷等，2010）。本研究發現，N添加對內蒙古溫性草原半干旱土壤 C礦化有抑制作用（圖 5）。白潔冰等（2011）研究發現N素輸入對高寒濕地和高寒草甸土壤C礦化沒有影響，而呂殿青等（2007）研究發現外加N對黃綿土有機質礦化有促進作用。N素添加對土壤SOM分解受土壤中微生物分泌胞外酶濃度、酶動力學、土壤養分、C?N的影響（Kuzyakov et al.，2000；Schimel et al.，2003）。滿足微生物最適生長的土壤C?N為 25?1（陳曉鵬，2013），當土壤C?N低于此值時，微生物對C源的需求更強烈。單獨添加N源時，微生物為了滿足N礦化或者對N的固持能量的需求，即自身生長和代謝需要更多的C源，因此微生物表現為對土壤C的固持，從而抑制了土壤原有有機質的分解。Parnas（1976）研究表明當 SOM 的 C?N比接近于適宜微生物生長的C?N比時，微生物的生長和代謝加快，同時微生物分泌的酶增加，酶的增加能加速C的分解。在東北松嫩草原進行不同種類和濃度梯度的 N添加實驗發現，適宜濃度的無機-有機混合 N添加能更好地促進微生物和土壤酶活性從而加速 C的分解利用（Wang et al.，2020）。但究其根本松嫩草原土壤含C量高，主要受 N素限制，而半干旱土壤 C?N比為10?1（表1），顯著小于最適微生物生長的C?N比，因此微生物生長處于“休眠”狀態，若沒有外源有機碳的供應，微生物生命生長和代謝也受到一定程度的抑制。綜上所述，對于半干旱土壤，在單獨添加外源N條件下，土壤原有SOM分解被抑制，導致土壤C礦化減少。

圖5 外加C源和N源對SOM礦化量的影響Fig.5 The effects of C and N addition on SOM mineralization

4.3 外加碳源和氮源對土壤礦化的影響

呂殿青等（2007）研究表明外加C、N對不同土壤肥力的土壤產生正激發效應，而且還存在一定的交互作用（即本研究中的疊加效應AE）。向土壤中添加不同的作物秸稈在短期內引起了明顯的激發效應，并且與秸稈中所含有的C、N的易分解性密切相關（Schmatz et al.，2017）。丘清燕等（2019）對不同恢復年限的森林土壤進行了葡萄糖添加實驗，結果表明在恢復初期C添加使土壤產生正激發效應，并且有累積激發C量與土壤N素的改變量呈顯著正相關（R2=0.44，P＜0.05），即說明C添加對土壤激發效應的影響是受到土壤N調控的。本研究結果也顯示同時外加C源與N源對有機質C礦化表現出更強的正激發效應（圖5，圖4）。同時，也與Chen et al.（2014）同時添加蔗糖和外源N到土壤中加速原有SOM的礦化作用類似。微生物掘N理論（Microbial nitrogen mining）認為，低的有效性N促進微生物胞外酶的分泌，加速SOM的分解，從中獲取所需的N和其他養分（Craine et al.，2007；Fontaine et al.，2011），該理論認為K對策微生物的生長和代謝能解釋激發效應的產生。Blagodatskaya et al.（2007）研究發現激發效應強度取決于C和N的添加水平，且激發效應受微生物種群結構影響，添加不同基質會引起微生物種群結構和生長策略的變化。另一種化學分解理論（Stoichiometric decomposition theories）認為，r對策微生物的生存策略能解釋C、N外源物添加后SOM礦化作用增加并且產生正激發效應。本研究發現，同時添加C源和N源，對激發效應產生疊加效應（比單獨添加葡萄糖引起更強的激發效應），可能的原因是內蒙古半干旱土壤主要受能源C的限制。適量活性C源與無機N同時加入土壤，能更好地激發受C源和N源限制的微生物的活性，也使土壤中微生物群落種類多于只添加C源條件下微生物種類，微生物種類增加在一定程度上增加了可以降解C復雜組分的酶（Hamer et al.，2005），從而促進土壤原有有機質的分解，使激發效應增強。

5 結論

本研究通過室內模擬不同外源物質添加對土壤原有SOM礦化的影響，明晰半干旱草原土壤在生長季最適溫度與水分充足條件下SOM的最大潛在礦化能力。結果表明：向內蒙古半干旱土壤單獨添加C源（葡萄糖），土壤原有SOM礦化過程產生了顯著的激發效應；單獨添加N源（AM和NT）對內蒙古半干旱土壤的C礦化過程具有一定的抑制作用但無顯著性差異；同時向半干旱土壤中添加C源和N源（葡萄糖和AM以及葡萄糖和NT）不僅對土壤C礦化產生顯著的激發效應，還表現出了增強的正激發效應（即疊加效應AE）。內蒙古半干旱土壤主要受到C含量的限制，添加活性C源能顯著促進土壤的C礦化過程；同時添加活性C源和無機N能更好地激發土壤微生物活性，從而更有利于SOM的分解。