麥稻茬口期內施氮對土壤養分及微生物碳源利用的影響

王青霞 ，李美霖 ，陳喜靖，蘇瑤，王強，喻曼*，沈阿林*

1.浙江省農業科學院環境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江農林大學環境與資源學院，浙江 臨安 311300

秸稈還田通過增加對外源氮素的固定和自身氮素的分解利用，能夠提高作物的氮素利用效率（Van et al.，2005；成臣等，2018），是中國資源化利用的優先模式，特別是隨著國家相關政策的調控，秸稈還田技術得到快速推廣應用。但在長江中下游稻麥輪作區，實施秸稈還田過程尚存在著一些較為突出的生產問題，如麥稻茬口偏緊、秸稈腐熟慢，秸稈分解過程引起土壤微生物與水稻爭氮使苗期營養不足等。如何充分利用麥稻茬口緩解還田秸稈的腐解對土壤氮素的消耗，明確秸稈還田下土壤環境的短期響應機理，維持微生物-土壤-作物之間的養分供應平衡對解決當下存在的生產問題和推動秸稈還田技術的發展顯得尤為重要。已有秸稈還田的研究大多基于其對土壤環境的長期效應而開展，主要集中在還田方式（楊育川等，2016）、秸稈類型（南雄雄等，2010）、土壤水分（張素瑜等，2019）及秸稈腐熟劑（張麗霞等，2018）等方面，而對于茬口期內秸稈還田對土壤養分與微生物環境的短期響應機理鮮有涉及。

秸稈還田條件下施入銨態氮可通過調節土壤碳氮比進而促進秸稈腐解（趙士誠等，2014；Liang et al.，2012），半纖維素、纖維素的降解會得到提高（余少杰等，2013）。秸稈還田能促進土壤有機質的礦化作用，激發土壤原來有機質的分解，促進微生物的繁殖和活動，施入氮肥能促進土壤中有機氮的分解、釋放，但施入的無機氮也可能被微生物固定（潘劍玲等，2013）。沼液是一種緩速兼備、可循環再生的液體有機肥，通常含有大量銨態氮（鄭學博等，2016），以及大量可溶性有機碳等營養物質及對病蟲害有抑制作用的抗生素，易被植物吸收利用（Walsh et al.，2012）。尿素屬于酰胺態氮肥，經過土壤微生物作用能迅速轉化為銨態氮，是與沼液中氮素形態最為接近的化學肥料（熊淑萍等，2012），兩者皆可為秸稈腐解碳氮比調節提供有效的銨態氮。另一方面，施用沼液可能有助于降解麥秸腐解前期釋放的毒害物質，減輕其對水稻生長發育的抑制作用，同時軟化稻田耕層，利于水稻扎根，促進分蘗（趙亞慧等，2020；冉毅等，2020）。

土壤微生物作為秸稈腐解轉化的重要調控者，對微環境變化非常敏感（汪景寬等，2019）。微生物群落結構的改變可以快速反映土壤生態系統變化和環境脅迫反應（王曙光等，2004）。Biolog是一種通過測試微生物對單一碳源利用程度，反映微生物群體水平的生理功能輪廓及多樣性的分析方法（李志斐等，2014），從而得到被測微生物群落的代謝特征指紋，分辨微生物群落的微小變化（Campbell et al.，1997），最大限度的保留微生物群落原有的代謝特征，對于評價樣品對碳源底物利用能力具有優勢，同時，借助一些統計分析手段可提供微生物的碳源偏好信息，判斷微生物功能多樣性的差異（Haack et al.，1995；Garland et al.，1991；徐江兵等，2018）。本文通過模擬麥稻輪作茬口期麥稈還田土柱試驗，運用化學分析和Biolog分析法研究麥稈還田下茬口期內土壤有效養分和微生物碳源利用能力的變化，探討短期內氮肥添加對土壤環境的響應機理，為調控和優化麥稈腐解與水稻生長養分供應的秸稈還田方式提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤采自浙江安吉杭垓鎮桐杭村肥力中等的粉砂質水稻土，其土壤基本理化性質為：全氮0.25 g?kg-1，全磷 0.68 g?kg-1，全鉀 25.10 g?kg-1，有機質 4.50 g?kg-1。試驗用沼液取自嘉興科皇牧業有限公司沼液膜濃縮設備陶瓷膜出水（沼液原液為畜禽養殖廢棄物厭氧發酵后液相產物），其基本理化性質：全氮 1.28 g?L-1，全磷 0.07 g?L-1，全鉀 0.74 g?L-1，pH 7.59，Ec 9.25 ms?cm-1。供試秸稈為小麥秸稈，其基本理化性質：全氮6.54 g?kg-1，全磷0.13 g?kg-1，全鉀 14.60 g?kg-1。

1.2 試驗設計

模擬土柱試驗于2017年5—6月在浙江省農業科學院試驗網室進行，設置4個處理，分別為無麥稈無氮肥（CK）、麥稈還田+無氮肥（CM）、麥稈還田+尿素（SN）、麥稈還田+沼液（SZ），每個處理5次重復。土柱直徑為64 cm，總高41 cm，每個土柱土壤88 kg，麥稈添加量為2 g?kg-1。SN和SZ處理氮投入水平為0.033 g?kg-1，其中SN處理中的氮以尿素（46%）形式投入，SZ處理的氮以沼液形式投入。為避免沼液中磷鉀養分的干擾，保持不同處理除氮外養分投入的一致，其它處理均補充與SZ處理沼液中等量的磷鉀，以過磷酸鈣（12%）和氯化鉀（60%）的形式投入。麥稈風干后切成5—10 cm碎段，與土壤充分混勻后分層均勻裝入盆中，然后保持土壤淹水（5—10 cm）的狀態，水分每隔2天補充一次。在土壤淹水后1 d和21 d采用四分法采集0—20 cm土樣，一部分直接用于Biolog分析，一部分風干用于土壤基本理化性質分析。

1.3 測定項目與方法

土壤養分指標測定方法參照鮑士旦（2000）的《土壤農化分析》，其中有效氮用堿解擴散法測定；有效磷用鉬藍比色法；速效鉀用火焰光度法。

微生物碳源利用能力采用 Biolog（Biolog-Eco PlateTM）方法進行分析。稱取相當于5 g干質量的鮮土加入到已裝有45 mL滅菌水的三角瓶中，室溫震蕩30 min，取1 mL土壤懸浮液離心20 min棄去上清液，加1 mL 0.85%生理鹽水，震蕩5 min使之混勻，重復3次，取0.5 mL上清液用生理鹽水稀釋至40倍液，吸取稀釋液接種到生態板（Biolog-ECO板）上，每孔加150 μL，將接種好的微平板置于25 ℃的恒溫培養箱中避光培養，每隔24 h在酶標儀（SpectraMax M5，美國MD）上讀取590 nm下的光密度值，持續240 h。用 31個孔的平均顏色變化率（average well color development，AWCD）表示微生物代謝的整體活性。計算Shannon指數（H′）、Pielou均勻度（E）、Simpson指數（D），具體計算公式如下：

式中，Ci是每個孔的光密度值，R是對照孔的光密度值，31是ECO板上的孔數。

式中，Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)。

式中，S為被利用的碳源總數。

1.4 數據處理

采用Origin 2017進行分析和繪圖，采用SPSS 21.0進行Pearson相關性分析、單因素方差分析、多因素方差分析（顯著性水平為α=0.05）和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 各處理土壤養分含量變化

添加麥稈1 d和21 d后的土壤養分含量變化如圖1所示，CM處理的有效氮含量較CK處理下降20.58%。在1 d時各處理的有效磷和有效氮含量無顯著差異；在21 d時，添加麥稈的SN、SZ處理有效磷含量較CK處理分別升高7.58%、23.20%。CM、SN、SZ處理速效鉀含量在兩個時期均顯著高于CK處理，21 d時，SN、SZ處理的速效鉀含量較CK處理分別升高14.22%和22.07%。茬口期1、21 d與各處理的交互作用對土壤有效氮、有效磷、速效鉀含量均有顯著影響。

圖1 各處理土壤養分含量Fig.1 Content of soil nutrient in each treatment

2.2 各處理土壤微生物碳源利用強度變化

平均顏色變化率（AWCD）是表征土壤微生物群落對底物碳源利用強度的指標，AWCD值越大，表明對碳源利用強度越強，微生物代謝活性越高（張恩平等，2018）。本試驗培養開始后，每隔24 h測定AWCD值，得到AWCD隨時間變化的動態圖。從圖 2可以看出，各處理土壤微生物碳源代謝AWCD值的變化趨勢均隨著培養時間的延長而升高，0—120 h：各處理AWCD值迅速升高，微生物呈指數增長，說明土壤微生物從0 h后開始大量利用底物，土壤微生物碳源代謝活性顯著提高。120 h后：各處理AWCD值基本趨于平緩，此時土壤微生物活性達到穩定。1 d時，添加麥稈處理的AWCD值明顯高于空白，均穩定在1.5—1.7之間，且表現為CM＞SZ＞SN，CK的AWCD值僅為0.8；21 d時，添加麥稈處理的AWCD值較1 d時有所下降但仍高于空白，穩定在1.0—1.2左右，各處理間差異不大，表現為SZ＞CM＞SN，CK的AWCD值仍穩定在0.8。添加麥稈各處理 AWCD值均顯著高于空白，表明麥稈還田能激活土壤微生物的碳源利用能力。

2.3 各處理土壤微生物群落各類型碳源利用特征

按照化學基團性質，31種碳源分碳水化合物（10種）、氨基酸（6種）、聚合物（4種）、胺類（2種）、酚酸（2種）、羧酸（7種）等共六大類碳源。分析各類碳源的 AWCD值可判斷各處理土壤微生物群落對特定類型碳源的利用能力。本文選取 120 h時的 AWCD值繪制各處理土壤微生物碳源利用能力圖（圖3）。1 d時，各處理土壤微生物群落在利用6種碳源間均存在顯著差異（P＜0.05）；21 d時，各處理土壤微生物群落代謝碳水化合物、氨基酸、聚合物、羧酸的能力存在顯著差異，代謝胺類、酚酸的能力無顯著差異。其中，1 d時，碳水化合物類、氨基酸類、聚合物類、酚酸類、羧酸類：CM、SN、SZ＞CK；胺類：CM＞SZ＞SN＞CK。21 d時，碳水化合物類、聚合物類：CM、SN、SZ＞CK；氨基酸類：CM、SZ＞SN＞CK；羧酸類：SN＞SZ＞CM＞CK。可以發現，1 d時土壤微生物胺類的AWCD值與上述 31種碳源的總體趨勢一致。麥稈還田處理土壤微生物對六類碳源的代謝能力始終高于 CK。茬口期1 d、21 d與各處理的交互作用會對酚酸和羧酸這兩類碳源的微生物利用能力造成顯著影響。

圖2 各處理平均每孔顏色變化率Fig.2 Average color change rate per well for each treatment

2.4 各處理土壤微生物群落功能多樣性指數

Shannon物種指數、Pielou均勻度指數和Simpson優勢度指數可以反映土壤微生物群落的功能多樣性。不同的多樣性指數反映功能多樣性的不同方面，Shannon物種指數反映群落物種及其個體數；Pielou均勻度指數反映群落個體分布的均勻度；Simpson優勢度指數則反映群落中最常見物種的優勢度（鄭學博等，2016）。各處理Biolog-Eco板培養120 h時的土壤微生物群落功能多樣性指數見表1。Shannon物種指數：1 d和21 d時均表現為添加麥稈處理與CK存在顯著差異，表明添加麥稈有利于提高微生物多樣性。Pielou均勻度指數：1 d時添加麥稈處理與CK存在顯著差異，21 d時SN和SZ處理與CK存在顯著差異，表明添加麥稈施氮（尿素或沼液）有利于提高土壤中微生物種類的均勻分布。Simpson優勢度指數：1 d時添加麥稈處理與CK存在顯著差異，21 d 時各處理之間無顯著差異，表明添加麥稈與施氮沒有明顯增強各處理土壤微生物種群的優勢度。

2.5 各處理土壤微生物群落功能主成分分析（PCA）

土壤微生物群落功能多樣性反映了群落總體的變化，但未能反映微生物群落代謝的詳細信息，研究土壤微生物對不同碳源利用能力的差異，有利于更深入地了解微生物群落代謝功能特性。利用培養120 h的AWCD值，對不同處理土壤微生物利用單一碳源的特性進行主成分分析（PCA）。1 d和21 d各處理在PCA載荷圖上的分布相似，CK位于PC1正端，CM、SN、SZ位于PC1負端，且這三者距離相近，表明添加麥稈處理的土壤微生物對碳源的利用方式比較相近（圖4）。在PC2軸上，SN處理處于正端，SZ處理的絕對值最小，表明對PC2貢獻較大的碳源對SZ處理中微生物群落碳源利用影響較小。進一步分析PC2上的權值，權值越大表示對應碳源對該主成分的貢獻越大。1 d時，對PC2貢獻較大的碳源（權值≥0.50）主要為γ-羥丁酸、α-丁酮酸，兩者均屬于羧酸類。21 d時，對PC2貢獻較大的有碳水化合物類（α-D-乳糖）、羧酸類（D-葡萄胺酸、D-半乳糖醛酸）、酚酸類（2-羥基苯甲酸）和聚合物類（肝糖）。

表1 各處理土壤微生物群落功能多樣性指數Table 1 Functional diversity indexes of soil microbial communities in different treatments

圖3 各處理120 h時土壤微生物特征碳源AWCDFig.3 Soil microbial characteristic carbon source AWCD at 120 h in each treatment

2.6 土壤養分與Biolog相關性分析

對1 d和21 d的土壤養分與Biolog數據進行相關性分析，結果如表2所示。1 d時，速效鉀與碳水化合物、聚合物顯著正相關（P＜0.05）；21 d時，有效磷與碳水化合物、聚合物顯著正相關，速效鉀與碳水化合物、聚合物極顯著正相關（P＜0.01）。

3 討論

圖4 各處理土壤微生物群落功能主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial community function in different treatments

表2 土壤養分與Biolog相關性分析Table 2 Correlation analysis between soil nutrients and Biolog data

CM處理的有效氮含量較 CK處理下降20.58%，SN、SZ處理的有效磷含量較CK處理提高7.58%和23.20%，速效鉀提高14.22%和22.07%。秸稈中的鉀主要以 K+形態存在，秸稈中的磷約有60%以無機磷形態存在，其余則為難分解的有機磷，而秸稈中氮素大致可分為貯存性氮素和結構性氮素，貯存性氮素包括滯留在秸稈中的硝態氮（NO3--N）、銨態氮（NH4+-N）和一些小分子有機氮（氨基酸、酰胺等）；結構性氮素主要是難分解的有機氮，包括葉綠素、蛋白質（酶）、核酸、胺類、氨基化合物和各種維生素中的氮。貯存性氮素很容易從秸稈中釋放，但占比很小；結構性氮素是秸稈氮素主要組分，必須經微生物礦化為無機氮才能逐漸釋放，且釋放比較慢。麥稈中養分釋放速率表現為K＞P＞N（武際等，2011）。由于微生物分解秸稈需要從土壤中吸收一定量的氮素（馮曉赟等，2018），因此單純秸稈還田會顯著降低土壤銨態氮和硝態氮的含量（汪軍等，2010），降低耕層土壤氮的有效性（董林林等，2019），使土壤碳氮比升高。有研究發現，0—30 d為秸稈快速腐解期，30 d時秸稈養分釋放率達到最高值，土壤有機碳、全氮、堿解氮和速效磷含量增加的幅度也相應達到最大值，30 d后，還田秸稈養分釋放速度減緩（武際等，2013）。本次試驗結果表明茬口期內單純麥稈還田確實存在降低土壤中有效氮的趨勢，麥稈還田同時施氮是緩解水稻苗期供氮的有效手段。

添加麥稈處理的總 AWCD值均高于空白，且對六類碳源的利用能力較強。楊濱娟等（2014）研究表明，秸稈還田配施不同比例化肥對于合理調節土壤溫度、提高根際土壤微生物數量及酶活性方面有較好的促進作用。化肥或秸稈施入會促進微生物生長，使微生物的碳源利用率明顯升高（羅希茜等，2009）。在短期內土壤微生物對秸稈投入的響應比對化肥的響應更快（Bei et al.，2018）。還田麥稈為土壤微生物生長提供所需碳源和能源，使得土壤微域環境發生了改變，進一步促進了土壤中微生物活性的提高。Zhang et al.（2018）研究認為Shannon指數、Pielou指數和Simpson指數在有秸稈存在的土壤中顯著高于單一栽培的土壤，秸稈還田能有效提高土壤中的微生物多樣性。然而，對氮的競爭利用使土壤中優勢菌群突出，非優勢菌群受到抑制，降低了土壤中的微生物多樣性（陳春蘭等，2010）。麥稈還田能夠增加土壤微生物碳源代謝活性，有利于提高土壤微生物群落的物種多樣性，麥稈還田同時添加氮肥更有利于提高微生物群落的均勻度。

土壤中碳源變化會促進與碳源利用類型相對應的微生物的生長與繁殖，顯著影響土壤微生物的群落多樣性（Barney et al.，2017）。主成分分析表明各處理在微生物代謝功能上存在一定的差異性和相似性，添加麥稈各處理代謝規律相似，而與 CK存在較大的差異性，這與前人研究一致，即秸稈添加的土壤中微生物群落多樣性會發生顯著變化（Chen et al.，2018）。茬口期第1天，添加麥稈各處理的微生物群落對碳源γ-羥丁酸、α-丁酮酸代謝存在差異，第21天對α-D-乳糖、D-葡萄胺酸、D-半乳糖醛酸、2-羥基苯甲酸和肝糖代謝存在差異。羧酸可分離主要代謝有機物質，如碳氫化合物（Nagalakshmi et al.，2018）。D-半乳糖醛酸的利用效率提高，可誘導降解纖維素和木質素的微生物快速增殖（安麗蕓等，2017）。然而，在營養充足的條件下，酚酸容易被微生物利用表現出自毒作用，從而抑制微生物活性和生物量，并改變土壤微生物群落結構（Blum，1998；及利等，2019）。酚酸物質能減少微生物對其生長介質的消耗（陳曉娟等，2013），破壞受體膜的功能，改變受體生長激素吲哚乙酸（IAA）水平，抑制受體ATP酶活性。酚酸可能可以起到表征微生物活性高低的作用，在微生物活性低時，利用率較高，即特征碳源（王青霞等，2020）。有研究證實 2-羥基苯甲酸也是重要的化感自毒物質（劉燕等，2019）。因此，添加尿素處理雖然在土壤養分表征上與添加沼液處理相差不大，但是在微生物活性和代謝功能上存在差異。

土壤微生物碳源利用能力與土壤養分之間有著密切關系，土壤養分含量高低在很大程度上制約著土壤微生物量與生理功能多樣性，同時微生物量與生理功能多樣性又反過來影響著土壤的養分含量，兩者相互調節又互相影響（林生等，2012）。本研究對土壤養分和 Biolog數據進行的相關性分析表明，土壤中有效磷增加會導致微生物對碳水化合物、聚合物這兩類碳源利用能力的提高，鉀含量升高有利于增加微生物對碳水化合物和聚合物的利用能力。肝糖與土壤中磷素循環微生物有關（Schuler et al.，2003），是磷素富集微生物（PAO）好氧合成細胞內能量貯存物質（Seviour et al.，2003），在缺磷條件下，可作為PAO的碳源及能源物質，提高磷素的供給量（Zhou et al.，2009）。易于獲取的肥料養分會促進機會性細菌的發展（De et al.，1993），這可能是導致土壤中微生物碳源利用情況變化的原因之一。

4 結論

在麥稻茬口期麥稈還田同時施用氮肥能維持土壤中有效氮水平并促進有效磷和速效鉀的釋放；提高土壤微生物群落活性和功能多樣性，使得微生物群落更均勻分布；土壤中的磷鉀養分會促進微生物對碳水化合物和聚合物的利用和轉化，但添加尿素處理的微生物活性和代謝功能在 21 d時可能受到抑制，因此，茬口期麥稈還田與沼液配施更適宜緩解麥稈腐解與水稻苗期養分供應之間的矛盾，提高土壤的生態健康水平。