Tween 80作用下芘降解細菌Pyr9在三葉草中的定殖及效能

陳志高，顧玉駿，張海麗，劉娟，高彥征

（南京農業大學資源與環境科學學院，南京210095）

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是環境中廣泛存在的一類持久性有毒有害有機污染物，主要由煤、石油、木材、有機高分子化合物等有機物在不完全燃燒或高溫（＞700 ℃）處理條件下產生[1-2]。2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》指出，我國土壤PAHs 總超標率為1.4%，說明我國土壤存在一定的PAHs 污染。PAHs 的強疏水性和脂溶性導致其容易吸附在土壤等固體顆粒物表面[3-4]。進入土壤中的PAHs 易被植物吸收積累，并可通過食物鏈傳遞和富集，從而對生態環境和人體健康造成一定的危害[5]。調控植物對土壤中PAHs 的吸收作用，進而減低作物PAHs 污染風險，對于在PAHs 污染區生產安全的農產品意義重大。

研究發現，一些表面活性劑對PAHs 有增溶作用，可用于調控植物對PAHs 的吸收和積累。Gao 等[6]研究顯示，添加適量濃度的月桂醇聚氧乙烯醚（Brij35）（≤74 mg·L-1）可提高菲和芘的溶解度，促進植物對菲和芘的吸收；而高濃度的Brij35（≥148 mg·L-1）可與菲和芘產生競爭，并對植物有一定的毒害作用，抑制植物的吸收。Liao等[7]研究指出，向土壤中添加適量表面活性劑可以增加PAHs 的解吸率，提高PAHs的生物可利用性，并促進玉米對PAHs的吸收積累。此外，表面活性劑還可以強化微生物-植物聯合作用對土壤中PAHs 的去除。研究表明，添加生物表面活性劑鼠李糖脂和大豆卵磷脂，不僅可以顯著提高根際土壤中微生物數量和總石油烴的生物可利用性，還促進了植物根系對總石油烴的吸收積累和微生物降解[8]。Ni 等[9]的研究也表明，與不添加表面活性劑相比，添加表面活性劑Tween 80 提高了植物與微生物聯合作用對土壤中菲和芘的去除率，分別提高了49.8%和48.1%。

除表面活性劑外，在植物根際或體內定殖功能微生物，也可有效控制植物對PAHs 的吸收和積累[10-11]。Sun 等[12]從生長于PAHs 污染區的健康植物體內分離出一株芘降解內生細菌Staphylococcussp.BJ06，該菌能良好定殖于植物根際、根內和莖葉內，并可以促進植物生長和芘的代謝；相比不接菌植物，接菌植物根部和莖葉部芘的含量分別降低了31.01%和44.22%。Lenoir 等[13]研究表明，叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在植物根部形成的菌根可以促進植物生長及其對根際PAHs 等持久性有機污染物的吸收和去除；此外，AMF 還可引起植物根系分泌物濃度和成分的改變，吸引根際微生物在植物根表大量聚集，其中不乏PAHs 降解菌[14]。另外，有些AMF自身含有過氧化物酶等酶系[15]，可直接降解PAHs 等有機污染物。然而，有關表面活性劑對降解細菌在植物體內定殖和分布的影響知之甚少，有關表面活性劑作用下降解細菌的定殖對植物吸收積累PAHs 的影響也尚不可知。

基于此，本研究擬以非離子型表面活性劑Tween 80、芘降解細菌Pyr9 和三葉草作為供試對象，采用溫室土培實驗，研究不同劑量Tween 80 作用下Pyr9 在三葉草根際和體內的定殖與分布情況，并探討Tween 80 作用下Pyr9 的定殖對三葉草吸收芘的影響。研究結果有望初步闡明表面活性劑作用下植物來源的降解細菌在植物中的定殖和效能，為在PAHs 污染區生產安全的農產品提供理論依據，也為PAHs 污染土壤的“邊修復邊生產”提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：芘降解細菌Mycobacteriumsp.Pyr9，屬環境分枝桿菌，具有氨芐青霉素和氯霉素抗性，分離于PAHs 污染區植物牛筋草[Eleusine indica（L.）Gaertn.]根表，保存于本實驗室-70 ℃冰箱。

植物：三葉草，品種為白車軸草（Trifolium repensL.），其種子購自江蘇農科種業研究院有限公司。

芘（Pyrene，純度≥98%）購自德國Fluka 公司，其相對分子量為202.26，25 ℃純水中溶解度為0.12 mg·L-1，辛醇-水分配系數（logKow）為5.18，其溶液以丙酮為溶劑配制；甲醇、乙腈和丙酮為色譜純，購自南京化學試劑股份有限公司；聚氧乙烯（20）失水山梨醇單油脂肪酸（Tween 80），購自國藥集團；其他試劑均為分析純，購自國藥集團。

LB 培養基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。無機鹽培養基（MSM）：（NH4）2SO41.50 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.91 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，KH2PO40.50 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.20 g·L-1，微量元素溶液2 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。微量元素溶液：CoCl2·6H2O 0.1 g·L-1，MnCl2·4H2O 0.425 g·L-1，ZnCl20.05 g·L-1，NiCl2·6H2O 0.01 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.015 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.01 g·L-1，Na2SeO4·2H2O 0.01 g·L-1。芘降解培養基（PMM）：2 g·L-1的芘丙酮溶液過0.22μm 濾膜除菌，取一定量置于滅菌的三角瓶中，待丙酮揮發完全后加入滅菌的MSM，使芘的最終濃度達到50 mg·L-1。若制備固體培養基，則向上述液體培養基中加入18 g·L-1的瓊脂。滅菌條件：溫度121 ℃，時間20 min。

1.2 細菌Pyr9以芘為碳源的生長與降解曲線測定

向無菌的50 mL 玻璃三角瓶中加入一定量芘丙酮母液，待丙酮揮發后加入滅菌的20 mL 無機鹽溶液，使芘的濃度為50 mg·L-1（丙酮含量＜0.5%），再以2%的接種量加入菌株Pyr9 的新鮮菌懸液（OD600nm=1.0，對照組加等量滅活菌懸液）；處理組和對照組皆設置8 個取樣時間點，每個時間點3 個重復，共48 個三角瓶，于30 ℃、180 r·min-1條件下搖床恒溫培養，培養時間為14 d；期間每2 d同一時間取出每組設置的3個三角瓶，加入2 倍體積的甲醇，超聲30 min 后靜置2 h，取適量溶液過0.22μm 孔徑的有機相濾膜，裝于液相瓶中，保存于-20 ℃冰箱，待測定[12]。同時，在加入甲醇之前，將搖瓶中培養基搖勻后取0.5 mL 培養液，采用梯度稀釋涂布平板法進行菌落計數[12]，并以此計算培養液中細菌Pyr9的數量。

培養液中芘的含量用島津LC-20AT 高效液相色譜儀（HPLC）測定[16]，其檢測條件為：色譜柱為Φ4.6 mm×250 mm 烷基C18 反相柱；流動相為甲醇/水（V∶V=90∶10），流速1 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量20μL；檢測時間8 min；檢測波長254 nm。

1.3 供試土壤的采集和處理

供試土壤取自南京某農田表層土壤（0～20 cm），類型為黃棕壤，其中PAHs未檢出。土壤pH 6.03，有機碳含量14.3 g·kg-1。土樣采集后，風干，過10目篩；取少量風干土壤添加適量含芘的丙酮溶液，充分混合均勻；待丙酮完全揮發后，將含芘的風干土壤與剩余風干土壤充分混合均勻。其中芘的添加量參考研究組之前調查的長三角地區石化廠周邊PAHs重污染區表層土壤中的實際PAHs 總含量。稱取300 g 上述土樣于盆缽中，在50%田間持水量下平衡老化60 d 后待用。測得土壤中芘的初始含量為7.86 mg·kg-1。

1.4 盆栽實驗設置

三葉草種子經10%雙氧水浸泡消毒5 min 后立即用無菌水沖洗[17]，在蛭石中催芽至10 cm 后移栽至污染土壤中，每盆留苗12株。

實驗設置4個處理：空白對照組（CK），污染土壤；種植植物組（CP），污染土壤+三葉草；接菌組（CB），污染土壤+Pyr9；灌根組（CPR），污染土壤+三葉草+Pyr9灌根。CPR 是于移栽后取10 mL Pyr9 菌懸液（OD600nm=1.0）均勻灌溉于三葉草根部，CP 以滅活的菌液做相同處理，CB 為同時取10 mL 菌懸液均勻灌溉于土壤中。移栽植物3 d后向各處理土壤中施入不同濃度的Tween 80 溶液，其終濃度設置為：0、100、250、500、1 000 mg·kg-1干土。每個處理設置3 組重復。試驗期間設定溫度為白天25 ℃，夜晚20 ℃。植物生長過程中定期澆水，每2 d 隨機交換盆缽的位置。為了及時檢測細菌Pyr9 在土壤-三葉草中的分布，灌根處理10 d后即采集土壤和三葉草樣品，檢測其中的芘含量和Pyr9數量。

1.5 三葉草生物量的測定

收集培育好的新鮮植物樣，用滅菌毛刷輕輕擦去根部土壤，再用無菌水沖洗植株至少3 min，將植株根系和莖葉表面附著物全部沖洗干凈后，用吸水紙吸干植株表面水分。將三葉草根和莖葉分開，用萬分之一分析天平分別稱量其鮮質量，并記錄數據。

1.6 根際土壤和三葉草中功能細菌Pyr9的數量測定

菌株Pyr9 具有氨芐青霉素和氯霉素抗性，且在芘降解平板上可形成降解圈，以這些特征作為標記對定殖在土壤和植物中的菌株Pyr9 進行計數。取5.0 g根際土壤，置于裝有45 mL 無菌水的三角瓶中，內置玻璃珠數顆，于搖床220 r·min-1振蕩10 min 后，立即吸取土壤懸液梯度稀釋并涂布于含有氨芐青霉素（75 mg·L-1）和氯霉素（25 mg·L-1）的芘降解固體培養基上，30 ℃恒溫培養7 d，于紫外燈下觀察菌株Pyr9生成的降解圈，并對菌株Pyr9 進行計數，以計算每克土壤中的細菌Pyr9數量。為防止將其他細菌計入其中，隨機挑取平板上生成降解圈的菌株進行16S rRNA 基因的PCR 擴增和測序[10]，確定其為細菌Pyr9。三葉草生物量測定后，將其根和莖葉分開，分別取適量樣品置于無菌研缽中，添加無菌水研磨成懸液，按上述方法對定殖于三葉草中的菌株Pyr9進行計數。

1.7 土壤和三葉草中芘含量的測定

1.7.1 土壤中芘含量的測定

取一定量冷凍干燥后的土樣置于研缽中，充分磨碎后過20 目篩，取2 g 上述土樣于玻璃離心管中，加入10 mL 體積比為1∶1 的二氯甲烷與正己烷的混合液，蓋緊蓋子后超聲萃取1 h，以4 000 r·min-1的速度離心10 min，再取5 mL上清液過2 g-2 g無水硫酸鈉-硅膠柱，并用10 mL 體積比為1∶1 的二氯甲烷和正己烷溶液洗脫，將洗脫液收集至旋轉蒸發瓶，40 ℃恒溫下濃縮至干，用甲醇定容到2 mL，過0.22 μm 孔徑濾膜后，用HPLC/UV檢測分析[18]。

1.7.2 三葉草中芘含量的測定

將植物的根和莖葉用剪刀剪斷，分裝于自封袋中，置于冷凍干燥機中冷凍干燥2～3 d，將冷凍干燥后的植物根和莖葉用研缽充分研磨粉碎，然后稱取一定量植物樣于30 mL玻璃離心管中，再加入10 mL二氯甲烷和正己烷（V∶V=1∶1）的混合溶液超聲萃取30 min，重復3次[19]。按照1.7.1的方法進行三葉草中芘含量測定。

1.8 芘在三葉草中的富集和轉移系數計算

三葉草中芘富集系數（Plant concentration factor，PCF）的計算方式為[12]：

式中：Cp表示三葉草中芘的含量，mg·kg-1；Cs表示土壤中芘的含量，mg·kg-1。

三葉草中芘轉移系數（Translocation factor，TF）的計算方式為[12]：

TF=SCF/RCF

式中：SCF 表示芘在三葉草莖葉中的富集系數；RCF表示芘在三葉草根中的富集系數。

2 結果與分析

2.1 以芘為碳源的細菌Pyr9生長曲線與芘降解曲線

菌株Pyr9 的生長和芘降解曲線如圖1 所示，經過2 d 的適應期后，菌株Pyr9 進入快速代謝芘的階段，同時菌株數量快速增加。當培養至第10 d 時，菌株Pyr9 對芘的降解率已在95%以上，同時菌株到達穩定期；而相同時間內添加了等量滅活菌株的對照組中芘濃度因非生物因素僅降低了8.64%，這表明細菌Pyr9 對芘有良好的降解能力。在10～12 d 時，殘留的芘進一步被代謝完全，菌株Pyr9 則停止增殖，其數量略有下降。

圖1 以芘為碳源的芘降解曲線和菌株Pyr9生長曲線Figure 1 The pyrene-degrading and Pyr9 growth curve of strain Pyr9 with pyrene as the carbon source

2.2 不同添加量Tween 80 作用下細菌Pyr9 在土壤和三葉草中的定殖和分布

不同添加量Tween 80 作用下菌株Pyr9 在土壤和三葉草中的數量變化如表1 所示。當Tween 80 添加量在100～500 mg·kg-1范圍時，CB 組和CPR 組土壤中Pyr9 的數量皆略高于未添加Tween 80 處理；而當Tween 80 添加量為1 000 mg·kg-1時，CB 組土壤中Pyr9的數量有所下降。隨著Tween 80添加量的增長，定殖在三葉草根部和莖葉部的Pyr9 數量也呈現先增后減的趨勢，其中100 mg·kg-1的Tween 80 最有利于菌株Pyr9的定殖和生長。與土壤中類似，當Tween 80添加量為1 000 mg·kg-1時，定殖在三葉草體根部和莖葉部的Pyr9數量開始下降。

2.3 不同劑量Tween 80 的添加和細菌Pyr9 的定殖對三葉草生長的影響

不同劑量Tween 80 的添加和細菌Pyr9 的定殖對三葉草根部和莖葉部生物量（鮮質量）的影響如圖2所示。在供試Tween 80 劑量范圍內，CP 組和CPR 組三葉草根部和莖葉部的生物量隨Tween 80 含量的增加呈逐漸減少的趨勢。如當Tween 80添加量為1 000 mg·kg-1時，CP 組三葉草根部和莖葉部的生物量（455 mg 和1 353 mg）較不添加Tween 80 對照組三葉草根部和莖葉部的生物量（583 mg 和1 607 mg）分別減少了22%和16%。菌株Pyr9 的定殖在不同Tween 80 添加劑量下均可顯著提高三葉草的生物量（P＜0.05）。如當Tween 80 含量為500 mg·kg-1時，CPR 組三葉草根部的生物量（632 mg）比CP 組（503 mg）提高了26%，而莖葉部生物量（1 719 mg）則比CP 組（1 424 mg）提高了21%。

表1 土壤和三葉草中定殖的菌株Pyr9數量（log CFU·g-1 FW）Table 1 The cell counts of strain Pyr9 colonized in soil and white clover（log CFU·g-1 FW）

圖2 不同Tween 80添加量下三葉草的生物量Figure 2 The biomass of the white clover under different Tween 80 contents

2.4 不同劑量Tween 80 的添加和細菌Pyr9 的定殖對三葉草吸收積累芘的影響

不同劑量Tween 80 的添加和細菌Pyr9 的定殖對三葉草根部和莖葉部吸收積累芘的影響如圖3 所示。隨著Tween 80 添加量的增加，三葉草根部和莖葉部的芘含量整體呈上升趨勢。Tween 80 含量在0～250 mg·kg-1時，三葉草中的芘含量上升迅速，Tween 80 含量在250～1 000 mg·kg-1時，其上升相對平緩。不添加Tween 80 時，CP 組三葉草根部和莖葉部的芘含量分別為1.99 mg·kg-1和0.84 mg·kg-1，而添加250 mg·kg-1Tween 80 時其根部和莖葉部的芘含量分別為2.52 mg·kg-1和1.13 mg·kg-1，與不添加Tween 80 對照組相比分別提高了27% 和35%；而當Tween 80 含量為1 000 mg·kg-1時，CP組三葉草根部和莖葉部的芘含量分別為2.66 mg·kg-1和1.10 mg·kg-1，與不添加Tween 80對照組相比分別提高了34%和31%。

菌株Pyr9 在三葉草中的定殖能顯著降低三葉草體內的芘含量（P＜0.05），且添加Tween 80可增強菌株Pyr9 的作用效果。當不添加Tween 80 時，CP 組和CPR 組三葉草根部芘含量分別為1.99 mg·kg-1和1.83 mg·kg-1，莖葉部芘含量分別為0.84 mg·kg-1和0.76 mg·kg-1；與CP組相比，CPR組三葉草根部和莖葉部芘含量分別降低了8.0% 和9.5%。在Tween 80 添加量為500 mg·kg-1時，CP 組三葉草根部和莖葉部芘含量分別為2.44 mg·kg-1和1.16 mg·kg-1，此時CPR 組三葉草根部和莖葉部芘含量分別為1.98 mg·kg-1和0.92 mg·kg-1，與CP 組相比分別降低了19%和21%。以上結果表明，相較于細菌Pyr9 的單獨作用，添加適量Tween 80 和細菌Pyr9 共同作用對于降低植物體內的芘含量效果更為顯著（P＜0.05）。

圖3 不同Tween 80添加量下三葉草中的芘含量Figure 3 The contents of pyrene in the white clover under different Tween 80 contents

2.5 不同添加量Tween 80 作用下細菌Pyr9 和三葉草共同作用對根際土壤中芘的去除

不同添加量Tween 80 處理下土壤中的芘殘留含量如圖4所示。從圖中可以看出，在0～500 mg·kg-1范圍內，隨著Tween 80 含量的增加，土壤中的芘含量呈逐漸降低的趨勢。Tween 80添加量為500 mg·kg-1時，CK 組土壤中芘含量為2.78 mg·kg-1，而不添加Tween 80 的CK 組為4.28 mg·kg-1，前者與后者相比土壤中的芘含量降低了35%。相較之下，Tween 80添加量為1 000 mg·kg-1時，CK 組土壤中的芘含量（3.54 mg·kg-1）不再繼續減少，反而有所增高，但仍低于不添加Tween 80的CK組（4.28 mg·kg-1）。

圖4 不同Tween 80添加量下土壤中的芘含量Figure 4 The pyrene residues in soils under different Tween 80 contents

對相同劑量Tween 80 處理下CP 組、CB 組與CPR組土壤中芘的殘留量進行比較發現，CPR組的芘含量要顯著低于CP 組和CB 組（P＜0.05）。如當Tween 80添加量為100 mg·kg-1時，CP 組、CB 組和CPR 組土壤中芘的殘留量分別為3.37、3.64、2.94 mg·kg-1，CPR 組比CP組和CB組分別降低了13%和19%，這表明相對于三葉草或菌株Pyr9的單獨作用，三葉草和菌株Pyr9的共同作用對土壤中芘的去除效果更佳。當Tween 80 添加量為500 mg·kg-1時，CPR 組土壤中芘的殘留量為2.17 mg·kg-1，與不添加Tween 80 的CK 組（4.28 mg·kg-1）相比降低了49%。綜上所述，添加適量Tween 80 有助于提高三葉草和菌株Pyr9 共同作用下對土壤中芘的去除。

為了及時檢測功能細菌Pyr9 在根際土壤和三葉草中的分布，盆栽培養10 d后即采樣檢測了根際土壤和三葉草體內的芘含量，此時Tween 80-細菌Pyr9-三葉草共同作用對土壤中芘的去除并不徹底；若培養時間延長，該體系下的芘污染最終應該會被徹底消除。

2.6 不同劑量Tween 80-細菌Pyr9 共同作用下芘在三葉草中的富集和轉移系數

進一步計算了不同Tween 80 添加量下三葉草對土壤中芘的富集系數以及芘在三葉草中的轉移系數，結果如表2 所示。添加不同劑量Tween 80 均使三葉草中芘的富集系數顯著升高（P＜0.05），說明Tween 80促進了三葉草對土壤中芘的富集作用，增強了其芘污染風險；而接種功能細菌Pyr9 可在一定程度上降低這種風險。隨著Tween 80 添加量的增加，三葉草中的芘富集系數整體呈先升后降的趨勢；Tween 80添加量為500 mg·kg-1時，三葉草根部和莖葉部的芘富集系數最高。相較而言，芘在三葉草中的轉移系數相對穩定，在Tween 80 添加量改變或是否接種功能菌株Pyr9情況下的變化不大，說明芘從三葉草根部向莖葉部的轉移受Tween 80或功能細菌Pyr9的影響不大。

表2 不同Tween 80添加量下三葉草對土壤中芘的富集系數和轉移系數Table 2 The PCF and TF of pyrene in the white clover under different Tween 80 contents

3 討論

相比于陰離子和陽離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑具有低毒性、易被生物降解的特點[20]；Tween 80作為典型的非離子型表面活性劑，被廣泛應用于土壤PAHs的植物-微生物聯合修復[21]。本研究發現，中低劑量的Tween 80（≤500 mg·kg-1）可以促進降解細菌Pyr9 在土壤中的定殖和生長，而高劑量的Tween 80（1 000 mg·kg-1）則會產生抑制作用。這可能是由于低劑量的Tween 80促進了土壤中芘的溶出[22]，增加了芘的生物可利用性[23-24]，進而促進了Pyr9 的增殖[7]；而高劑量的Tween 80 對Pyr9 有毒害作用，抑制了其增殖[25]。定殖于三葉草中的Pyr9的數量變化規律與土壤中類似，Tween 80 含量為100 mg·kg-1時其數量最高，在土壤中則是Tween 80 含量為500 mg·kg-1時其數量最高。造成這種差異的原因可能是高劑量Tween 80對植物根部有損害[7]，不利于菌株Pyr9 從三葉草根際向體內的遷移。此外，高劑量的Tween 80（500～1 000 mg·kg-1）顯著抑制了三葉草的生長。推測原因，一方面是因為Tween 80對植物根部細胞有毒害作用[26]，劑量越高，其對植物的毒害作用越大；另一方面，高劑量Tween 80促進了土壤中芘的溶出，從而增強了芘對植物的脅迫作用。而細菌Pyr9 的定殖則使三葉草的生長抑制顯著減低，這是由于Pyr9本身具備的產吲哚乙酸（IAA）、產鐵載體以及溶磷能力促進了三葉草的生長；同時菌株Pyr9 可快速降解三葉草根際和體內的芘，緩解了高濃度芘對三葉草的生長脅迫作用。

添加適量Tween 80 可提高土壤中PAHs 等有機污染物的溶解性和生物可利用性，使其更容易被植物吸收或被微生物降解[26-27]。在本研究中，添加不同劑量Tween 80 均促進了三葉草對芘的吸收，且當Tween 80 含量在0～250 mg·kg-1時，三葉草中的芘含量隨Tween 80含量增加上升迅速。此外，隨著Tween 80含量的增加，土壤中的芘含量先減少后增加，說明高濃度Tween 80（1 000 mg·kg-1）不利于土壤中芘的去除。眾多研究也證實[20-21，28]，添加適量的Tween 80 能顯著提高PAHs 的生物降解率；而過量添加Tween 80 雖可促進土壤中PAHs 的解吸并提高PAHs 的溶解性，但會抑制PAHs 的生物降解過程。其原因有以下三點：（1）PAHs與Tween 80膠束結合，反而降低了其生物有效性[29]；（2）高濃度的Tween 80會破壞細菌細胞膜，導致細菌死亡[30]；（3）Tween 80 作為碳源和能源優先被微生物利用[31]。

PAHs降解細菌在根際土壤和植物中的定殖能有效減低植物體內的PAHs 含量，降低其PAHs 污染風險[12]。在本研究中，相比于不接種Pyr9 的三葉草，接菌處理的三葉草根部和莖葉部芘含量顯著降低，芘富集系數也明顯下降。研究表明，植物根際和體內存在數量可觀的PAHs 降解細菌，可用于植物-微生物聯合作用修復PAHs 污染[32-33]。在根際微生態環境中，植物根系分泌物（糖類、有機酸和氨基酸等）可為根際細菌提供營養物質，并且吸引根際細菌在植物根表定殖形成聚集體或細菌生物膜。根際細菌則可通過產生促生物質促進植物生長，或是通過降解PAHs 等有機污染物提高植物對污染環境的抗逆性[32，34]。此外，一些定殖在植物根表的PAHs 降解細菌還可進入植物體內成為內生細菌，直接降解植物體內的PAHs，或是誘導植物體內的PAHs 代謝酶系，加速植物體內PAHs 的去除[35]。另外，功能內生細菌也可通過基因水平轉移將自身的PAHs 降解基因轉移給其他植物內生細菌[36]，以加速植物體內PAHs 的降解，減少PAHs在植物組織中的積累。

目前已有的研究多是關注Tween 80 等表面活性劑對植物吸收代謝PAHs 或微生物降解PAHs 的影響，有關表面活性劑對降解細菌在植物根際和體內的定殖、分布以及效能的影響尚未見報道。本研究通過溫室土培實驗，研究了0～1 000 mg·kg-1的Tween 80作用下細菌Pyr9 在三葉草根部的定殖和分布以及對三葉草吸收累積芘的影響，獲得了一些初步的結果，為保障PAHs 污染區農產品安全提供了理論依據。但本研究尚有幾點不足之處，在此說明，并建議作為后續研究的關注點：（1）盆栽實驗所采用的PAHs 為單一芘污染，而實際環境中多為多種PAHs 復合污染，且濃度差異較大，在這種復雜的環境中應用該技術效果如何尚不可知；（2）為了及時追蹤菌株Pyr9 在三葉草中的定殖和分布，三葉草植株的整體培養時間較短，后續可開展不同培養時間的連續采樣檢測，以監測各個指標的動態變化；（3）不同劑量Tween 80 對植物根際和體內微生物群落結構以及PAHs 代謝酶系活性的影響未做探討。完成以上幾個方面的研究，方可全面深入地闡述Tween 80-植物-微生物-PAHs 之間的相互關系。

4 結論

（1）低劑量（100 mg·kg-1）的Tween 80可促進菌株Pyr9在三葉草中的定殖和生長，且對三葉草的生長影響不大。

（2）高劑量（≥500 mg·kg-1）的Tween 80 可抑制三葉草的生長，而菌株Pyr9 的定殖則可促進三葉草的生長。

（3）適當劑量Tween 80（100～500 mg·kg-1）的施用可有效促進菌株Pyr9降解三葉草中的芘。