云嶺牛HMGA2基因InDel多態及其與生長性狀的關聯分析

李世鵬，汪富文，史穎超，項門們，雷初朝，黨瑞華

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

隨著肉牛業的發展，市場對良種肉牛的需求不斷提高.中國的牛品種資源豐富，但多以役用為主，且培育程度較低，為了提高肉牛的生產性能，適應社會及市場需求，中國育種工作者不斷利用常規育種技術及現代生物技術等手段進行肉牛品種的選育.目前已培育出多個生產性能優異的肉牛品種，比如云嶺牛、夏南牛.云嶺牛作為中國第1個采用三元雜交方式培育、南方第1個擁有自主知識產權的肉用牛品種[1]，其在2014年通過了國家畜禽遺傳資源委員會的現場審定[2]，2015年已經被正式定為國家畜禽新品種[3].

云嶺牛是通過云南黃牛 (Yunnan Yellow)、莫累灰 (Murray Grey)和婆羅門牛 (Brahman) 雜交選育出來的[1]，具有耐熱抗蜱、抗病力強、生長發育快、飼料利用率高、性成熟早、難產率低、繁殖性能好等優點.其肉口感優良，鮮嫩多汁，市場價值極高，為南方肉牛產業發展，特別是為高檔雪花牛肉生產奠定了良好的種源基礎[3].但是云嶺牛因育成時間較短，個體間表型差異較大，仍需要在生長發育，特別是體尺性狀方面繼續進行系統地選育，以發揮和提高種群的生產優勢.借助分子標記輔助育種技術可以加快云嶺牛的選育，這對云嶺牛品種的發展及其遺傳資源的保護具有重要的意義.

HMG(high mobility group, HMG)蛋白由Goodwin等1973年在牛胸腺細胞中首次發現，因其在聚丙烯酰胺凝膠中具有高遷移率而得名.Bustin 將HMG 蛋白家族分為3 類：HMGA、HMGB 和HMGN，該家族成員皆有其特征性結構域，發揮著不同的作用[4].HMGA2是HMGA家族成員之一，在許多生物胚胎期及分化程度相對較低的組織中表達量高，而在高度分化的組織器官中表達量極低[5].HMGA2基因定位于人類染色體12q13-15位點上[6]，含有5個外顯子和4個內含子， 其中外顯子Ⅰ-Ⅲ分別編碼3個基本的DNA結合結構域 (AT鉤) ，外顯子Ⅳ編碼一段含有11個特定氨基酸的序列，這個特定序列在HMGA1上是缺失的，外顯子Ⅴ編碼酸性的C-末端結構域，是多種磷酸化的位點[7].HMGA2蛋白本身沒有轉錄活性，可以通過AT-hooks與DNA結合,繼而改變染色質的結構，使之發生彎曲、拉伸、卷曲、成環或解鏈,進而影響DNA依賴的細胞核過程，比如基因的轉錄、復制、重組及DNA修復[8].

目前研究最多的是HMGA2基因與癌癥的關系以及抗癌藥物的研發，如HMGA2基因在肝癌[9]、胰腺癌[10]、結腸癌[11]、胃癌[12]、甲狀腺癌[13]、卵巢癌[14]、前列腺癌[15]和膽囊腺癌[16]等癌癥組織中的表達及臨床意義.由于HMGA2在動物的生長發育過程中也發揮作用，是肉牛生長發育潛在的相關基因，故本實驗以云嶺牛為研究對象，探究HMGA2基因多態并分析其與體尺性狀的關系.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗以中國培育的第4個肉牛新品種云嶺牛個體(共計356個)作為實驗材料，樣品采集于云南昆明草地動物科學研究院.每個個體采集10 mL頸靜脈血樣至EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)抗凝采血管中，震蕩混勻后保存，保存溫度-80 ℃.采集的血液樣本采用全血/組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒提取血液基因組DNA，試劑盒購于天根生物科技有限公司.使用NanoDropTM1000 Spectrometer(Thermo Fisher Scientific)檢測提取后的DNA質量濃度及純度，并將其稀釋到50 ng/μL，置于4 ℃下備用.

采集血樣的同時對所采集的云嶺牛個體進行相關體尺數據的記錄，包括體高、體斜長、胸圍、腹圍、腰角寬、十字部高、 管圍、胸寬、胸深、臀圍、頭長、坐骨寬、額寬和尻長，以用于研究HMGA2基因的遺傳突變與云嶺牛體尺性狀之間的關系.

1.2 引物設計

根據西北農林科技大學Animal Omics Database數據庫(http://animal.nwsuaf.edu.cn)，找到牛HMGA2基因的一部分InDel位點，挑選突變可能性較高的1個潛在位點(ARS-UCD1.2 5:47872723).根據數據庫信息 ，此位點上發生了15 bp的缺失(序列為TCCCTTTTTTGCGCC)，根據NCBI上Genebank提供的HMGA2基因序列(登錄號 NC_037332.1)，利用Primer Premier5.0對該突變位點進行引物設計(表1)，由上海生工生物有限公司合成.

表1 云嶺牛HMGA2基因InDel引物設計序列

1.3 PCR擴增體系及程序

引物合成完成后，取30個不同DNA樣本各1 μL混合制作云嶺牛的DNA池.本次實驗使用12.5 μL的多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增體系，體系組成為2×Taq Master Mix 6.25 μL，4.75 μL ddH2O,上游引物和下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL.PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計32個循環；72 ℃延伸10 min,產物于4 ℃保存.完成后對擴增產物使用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行產物檢測.PCR擴增產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序.

1.4 Indel位點比對和驗證

測序結果使用DNAstar比對分析，確定云嶺牛上存在這一突變，在HMGA2基因(登錄號NC_037332.1)的ARS-UCD1.2 5:47872723位置上存在15 bp的缺失，缺失序列為TCCCTTTTTTGCGCC，和預期結果相符.

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳分型及基因型記錄

將所有云嶺牛樣品分批次進行PCR擴增，PCR體系不變.擴增完畢后將產物利用質量分數10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分型(200 V，120 min).使用Excel記錄所有的擴增結果的基因型.

1.6 數據統計

利用Excel等軟件分析遺傳多態性的指標，分別計算出基因型頻率和等位基因頻率.利用SHEsis在線軟件檢測實驗所用群體是否符合哈代-溫伯格平衡，使用MSRcall在線數據分析(www.msrcall.com/)進行群體遺傳學參數計算.利用SPSS20.0進行基因型和體尺性狀的關聯性分析,分析模型為Y=μ+a+b+c,其中Y代表個體表型記錄，μ代表群體均值，a代表年齡效應，b代表標記基因型效應，c代表隨機誤差[17].

2 結果與分析

2.1 云嶺牛HMGA2突變位點分型與測序驗證

將所有云嶺牛樣本采用質量分數10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，分型結果如圖1.野生型(II)為315 bp條帶，突變型(DD)為300 bp條帶，雜合型(ID)為315 bp 條帶和300 bp條帶，隨機各挑選1個樣本測序，測序結果和聚丙烯酰胺凝膠電泳分型結果一致(圖2).

圖1 HMGA2基因突變區域的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of HMGA2 gene mutation region

圖2 15 bp缺失純合測序結果Fig.2 Sequencing result of 15 bp InDel

2.2 基因型頻率、等位基因頻率及遺傳參數估計

從統計數據(表2)可知，云嶺牛在InDel位點存在3種基因型，分別是II、ID、DD.其占據優勢的等位基因是I. 經檢驗，云嶺牛群體此位點不處于哈代-溫伯格平衡(P<0.05).對該云嶺牛群體進行遺傳參數估計可知此位點多態信息含量(polymorphism information content，PIC)在0.25～0.50,屬于中度多態(表3).

表2 云嶺牛HMGA2基因InDel位點基因型頻率和等位基因頻率分布

表3 云嶺牛HMGA2基因InDel位點群體遺傳學參數估計

2.3 InDel位點與體尺性狀的關聯性分析

對云嶺牛多態位點的基因型與體高、體斜長、胸圍、腹圍、腰角寬、十字部高、 管圍、胸寬、胸深、臀圍、頭長、坐骨寬、額寬和尻長的關聯分析表明，云嶺牛DD基因型的腹圍顯著低于II和ID基因型的腹圍(P<0.05),ID和DD基因型之間差異不顯著(表4).

表4 云嶺牛HMGA2基因InDel位點多態性與其體尺性狀關聯分析

3 討論

3.1 HMGA2基因群體遺傳參數分析

通過對群體遺傳參數的分析，可以檢測出目標基因的遺傳多樣性和遺傳潛力.本實驗中云嶺牛的有效等位基因數為1.530 4，這表明該基因多態在云嶺牛群體中分布較為不均勻.PIC分析發現在云嶺牛群體中該位點PIC為0.285，介于0.25～0.50，屬于中度多態，說明該基因變異較大，有較大選擇余地.哈代-溫伯格平衡檢測，發現其在云嶺牛群體中不處于哈代-溫伯格平衡(P<0.05)，其占據遺傳優勢的等位基因是I，這說明可能具有DD基因型的個體的部分經濟性狀較低，在人工選擇過程中遭到了淘汰.這也說明了HMGA2基因對于云嶺牛的生產性能可能具有重大的影響，在選育中具有參考價值.

3.2 HMGA2基因多態性與生長性狀的關聯分析

HMGA2基因在真核生物中大量存在，該基因轉錄編碼含109個氨基酸的蛋白質,是高遷移率蛋白超家族的成員之一,因其分子質量小，且在凝膠電泳中遷移率高而得名.現有的大量研究發現HMGA2與人類腫瘤的發生發展密切相關，HMGA2可以結合細胞周期蛋白基因的啟動子進而上調細胞周期蛋白的表達,加速細胞周期G2/M期的轉化,促使腫瘤發生[18].此前已有研究表明，在胚胎發育晚期和分化完全的成熟細胞、組織中幾乎測不到其轉錄產物,HMGA2基因功能處于失活狀態[19]，但HMGA2在許多惡性腫瘤中呈高表達，HMGA2蛋白表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關.且已發現的所有哺乳動物的HMGA2蛋白具有同源性，它們都有相似的功能.在其他的動物如小鼠上，HMGA2的表達已被證實和骨髓間充質干細胞的更新過程[20]及精子發生過程[21]有關；在雞的研究中，宋遲等[22]發現HMGA2在雞的基因組中存在SNP，且與其體質量、周增質量也存在一定關系；在豬上，李平華等[23]發現HMGA2可能與耳面積有一定聯系.基于上述研究，可以得知HMGA2可能和細胞分化、胚胎發育等生理過程以及腫瘤細胞的增殖轉移有密切關系，據此推測HMGA2基因的表達水平可能對牛的生長發育有重要影響.在此實驗中，本課題組根據西北農林科技大學Animal Omics Database數據庫(http://animal.nwsuaf.edu.cn)進行了初步篩選，然后通過云嶺牛混池測序，在HMGA2基因的第3內含子上發現了15 bp的缺失序列，雖然內含子并不是編碼區，但是內含子會通過順式作用元件來調節基因的轉錄.本研究中，將HMGA2基因的多態位點與云嶺牛的生長性狀進行關聯性分析，發現該位點和云嶺牛生長性狀的腹圍指標顯著相關，ID與II的腹圍指標顯著高于DD(P<0.05).該突變可能通過增強或者抑制HMGA2基因的表達水平或者可變剪切來影響表達蛋白的能力，其作用機制有待進一步研究.

4 結論

本研究在HMGA2的第3內含子上發現15 bp的缺失突變，此突變與云嶺牛的腹圍指標顯著相關，可以作為云嶺牛生長性狀的候選分子標記輔助進行選擇和育種.